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The role of MEL-28 in nuclear pore complex formation

Walczak, Rudolf

German Title: Die Rolle von MEL-28 bei der Bildung des Kernprorenkomplexes

PDF, German
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The nuclear envelope (NE) is a highly specialized membrane system that surrounds the interphase nucleus of eukaryotic cells. Nuclear pore complexes (NPCs) form gated channels through the NE and mediate nucleocytoplasmic transport. In metazoan cells, the NE breaks down and reforms during each cell cycle. These events are tightly coordinated in space and time with the formation of the mitotic spindle and the segregation of chromosomes to the two daughter cells. At the end of mitosis, new NPCs begin to assemble on chromatin and an intact NE reforms around the decondensing chromosomes. MEL-28/ELYS is a recently identified NE protein essential for nuclear integrity and function in many organisms. Genetic mutation or RNAi depletion of MEL-28 severely impair nuclear morphology and lead to loss of NPCs from the NE in a variety of cells and organisms. Our work and that of others shows that MEL-28 is critically involved in postmitotic NPC formation, but at the same time links between MEL-28 and other cellular processes are emerging. This thesis aims at thoroughly characterizing the role of MEL-28 in nuclear assembly. It addresses the function of MEL-28 in living cells and examines the contribution of MEL-28 to nuclear assembly in vitro. MEL-28 is an NPC/INM protein in interphase and partly localizes to kinetochores in mitosis. RNAi knockdown of MEL-28 in human cells results in loss of nucleoporins (nups) from the NE, but leaves the NE membranes intact, suggesting that it is specifically involved in NPC assembly. This phenotype is mirrored by employing MEL-28-immunodepleted Xenopus laevis egg extract for nuclear assembly in vitro, which gives rise to nuclei devoid of pores. MEL-28 acts in NPC formation by targeting nups to chromatin. It interacts with a subset of nups, the Nup107-160 complex, which is a central building block of the NPC. MEL-28 binds directly to chromatin through its AT hook and additional chromatin binding motifs in its C-terminus. My data show that MEL-28 anchors the forming NPC to chromatin. Addition of high concentrations of AT hook to a nuclear assembly reaction leads to inhibition of NPC assembly and recapitulates the MEL-28 depletion phenotype. Recombinant MEL-28 rescues the recruitment of the Nup107-160 complex to chromatin, indicating that the depletion phenotype in nuclear assembly can be specifically attributed to MEL-28. The function of MEL-28 is under control of the Ran GTPase. RanGTP enhances MEL-28 and nup binding to chromatin and thus triggers NPC formation. Moreover, MEL-28 chromatin binding is regulated during the cell cycle, possibly by phosphorylation. In conclusion, this study extends our current model of postmitotic NPC formation by demonstrating that targeting of nups to chromatin is mediated by and requires MEL-28. MEL-28 function is regulated spatially by the Ran GTPase and coordinated temporally with the cell cycle. The involvement of MEL-28 in NPC formation is its best characterized function to date, but it is likely that MEL-28 has additional roles in other cellular processes. In addition, this thesis contains an initial characterization of NET5, a conserved transmembrane protein of the INM. NET5 has a well defined domain topology and localizes to foci in the NE which are not identical to nuclear pores. RNAi knockdown of NET5 in human cells perturbs nuclear integrity and leads to distortion of the NE, suggesting that it has an essential role in nuclear organization.

Translation of abstract (German)

Die Kernhülle stellt ein hochgradig spezialisiertes Membransystem dar, welches den Zellkern eukaryontischer Zellen in der Interphase umgibt. Kernporenkomplexe bilden Kanäle durch die Kernhülle und vermitteln den Transport von Molekülen zwischen Zellkerninnerem und Zytoplasma. In Vielzellern wird die Kernhülle bei jeder Zellteilung abgebaut, und bildet sich danach neu. Diese Vorgänge sind räumlich und zeitlich eng mit der Bildung der mitotischen Spindel und der Verteilung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen abgestimmt. Am Ende der Mitose bilden sich neue Kernporenkomplexe auf dem Chromatin, und eine intakte Kernhülle baut sich um die dekondensierenden Chromosomen auf. MEL-28/ELYS ist ein kürzlich identifiziertes Kernhüllenprotein, das in zahlreichen Organismen für die Integrität und Funktion des Zellkerns essentiell ist. Die genetische Mutation oder RNAi Depletion von MEL-28 beeinträchtigen die Gestalt des Zellkerns und führen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen zu einem Verlust von Kernporenkomplexen von der Kernhülle. Unsere Arbeit und diejenige anderer zeigen, dass MEL-28 an der Bildung von Kernporenkomplexen am Ende der Mitose beteiligt ist. Gleichzeitig wird jedoch, deutlich, dass MEL-28 auch in andere zelluläre Vorgängen eingebunden ist. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Rolle von MEL-28 bei der Bildung des Zellkerns umfassend zu charakterisieren. Sie beinhaltet Experimente zur Funktion von MEL-28 in lebenden Zellen und zum Beitrag von MEL-28 zur Zellkernbildung in vitro. MEL-28 ist Teil der Kernpore und der inneren Kernmembran in der Interphase, und ein Teil des zellulären MEL-28 bindet an Kinetochore in der Mitose. Die RNAi Depletion von MEL-28 in menschlichen Zellen hat den Verlust von Nukleoporinen von der Kernhülle zur Folge, nimmt jedoch keinen Einfluss auf die Kernmembran. Dieses Ergebnis legt nahe, dass MEL-28 spezifisch an der Bildung von Kernporenkomplexen beteiligt ist. Ein vergleichbares Ergebnis erhält man mit dem in vitro Kernbildungssystem, bei dem die Verwendung von MEL-28-immundepletiertem Xenopus laevis Eiextrakt zur Bildung von kernporenfreien Zellkernen führt. Die Funktion von MEL-28 besteht darin, Nukleoporine bei der Bildung des Kernporenkomplexes zum Chromatin zu führen. MEL-28 interagiert mit einer Gruppe von Nukleoporinen, dem Nup107-160 Komplex, einem zentralen Baustein des Kernporenkomplexes. Es bindet mittels seines AT hook Motifs und weiterer Chromatinbindungsmotive in seinem C-Terminus direkt an Chromatin. Meine Daten zeigen, dass MEL-28 den sich bildenden Kernporenkomplex am Chromatin verankert. Die Zugabe hoher Konzentrationen von AT hook zu einer Kernbildungsreaktion hemmt die Bildung von Kernporenkomplexen und führt zum gleichen Phänotyp wie die Depletion von MEL-28. Rekombinantes MEL-28 rettet die Bindung des Nup107-160 Komplexes an Chromatin, was verdeutlicht, dass der Depletionsphänotyp bei der Zellkernbildung spezifisch auf MEL-28 zurückzuführen ist. Die Funktion von MEL-28 wird durch die GTPase Ran reguliert. RanGTP verstärkt die Bindung von MEL-28 und Nukleoporinen an Chromatin und fördert so die Bildung von Kernporenkomplexen. Zusätzlich ist die Bindung von MEL-28 an Chromatin im Laufe des Zellzyklus reguliert, möglicherweise durch Phosphorylierung. Die vorliegende Arbeit erweitert unser Modell der Bildung von Kernporenkomplexen um die Erkenntnis, dass MEL-28 die Bindung von Nukleoporinen an Chromatin vermittelt. Die Funktion von MEL-28 ist räumlich durch die GTPase Ran reguliert und zeitlich mit dem Zellzyklus abgestimmt. Die Beteiligung an der Kernporenbildung ist die bisher bestcharakterisierte Funktion von MEL-28, aber es ist wahrscheinlich, dass es an weiteren zellulären Vorgängen beteiligt ist. Diese Arbeit umfasst zusätzlich eine initiale Charakterisierung von NET5, einem konservierten Protein der inneren Kernmembran. NET5 verfügt über eine klar definierte Topologie und ist in Foci in der Kernhülle zu finden, bei denen es sich nicht um Kernporen handelt. Die RNAi Depletion von NET5 in menschlichen Zellen zerstört die Integrität des Zellkerns und führt zu einer Auffaltung der Kernhülle. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NET5 eine essentielle Funktion für die Organisation des Zellkerns besitzt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Ellenberg, Dr. Jan
Date of thesis defense: 19 March 2009
Date Deposited: 31 Mar 2009 10:52
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Kernpore , Kernporenkomplex , Kernhüllenuclear pore , nuclear pore complex , nuclear assembly , nuclear envelope
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