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Theoretical and Experimental Examination of EGF Receptor Endocytosis

Schmidt-Glenewinkel, Hannah

German Title: Theoretische und Experimentelle Untersuchung von EGF Rezeptor Endozytose

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Abstract

In der hier präsentierten Arbeit behandeln wir die Zusammenführung von prädiktiven mathematischen Modellen und experimentellen Daten zu EGF Rezeptor Endozytose. Dieser Rezeptor ist vor allem für die Weiterleitung von Wachstumssignalen verantwortlich. In der Arbeit wurde insbesondere die Internalisierung selbst, sowie die Sortierung in Clathrin-abhängige wie -unabhängige Pathways untersucht. Das genaue Verständnis der Mechanismen von EGF Rezeptor Endozytose ist aus mehrfacher Hinsicht erstrebenswert: Endozytose, d.h. die Verlagerung des aktivierten Rezeptors von der Zelloberfläche in intrazelluläre Kompartimente, dient dazu, die Signalweiterleitung (Spezifität, Stärke, Dauer) zu kontrollieren. Entsprechend können abnorme Veränderungen des Endozytoseapparats z.B. durch Mutationen oder virale Infektion schwerwiegende Folgen für den zellulären Haushalt (Krebs) haben. Im ersten Teil der Arbeit präsentieren wir eine Kombination aus mathematischer Modellierung, konfokaler Mikroskopie und Mehrfarben-Flow Cytometry, um die Internalisierung in einzelnen Zellen quantitativ zu erfassen. Das Modell wird benutzt, um die Wirkung von Rezeptorüberexpression auf den Internalisierungsvorgang zu untersuchen (H.S-G et al, zur Publikation akzeptiert in JBC). Im zweiten Teil der Arbeit legen wir ein mathematisches Modell vor, welches die Sortierung von aktivierten Rezeptoren in unterschiedliche Endozytosewege beschreibt. Dies ist nicht nur aus biologischmedizinischen Gründen, sondern auch aus Sicht der mathematischen Modellierung und Systembiologie interessant, da sie als Beispiel für einen allgemeinen zellulären Entscheidungsprozess aufgefasst werden kann. Das hier vorgelegte Modell beinhaltet den Mechanismus eines Schalterverhaltens, welches kontinuerliche Signale in ein 'Alles-oder-Nichts' Outputverhalten umwandelt (H.S-G et al, BMC Systems Biology, 2008). Die mathematische Struktur und die Relevanz für zellbiologische Prozesse dieser Art von Modellen wird in der Einleitung ausführlich besprochen. Schließlich, um das erarbeitete Modell experimentell zu testen, wurden quantitative Vorhersagen abgeleitet, die vor allem mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie untersucht wurden. Um die Bilddaten auszuwerten, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Bildverarbeitungssoftware entwickelt, mit der sich Vesikelstrukturen automatisch detektieren und quantifizieren lassen (Manuskript zur Veröffentlichung eingereicht). Diese experimentellen Untersuchungen werden im dritten Ergebnisteil vorgestellt. Hierbei wurde insbesondere selektive Hemmung von Clathrin- oder Caveolin-abhangigen pathways auf das Endozytoseverhalten des EGF Rezeptors untersucht. Das Hauptergebnis dieses Teils der Arbeit ist, dass aktivierte Rezeptoren vorrangig über Clathrin-abhängige Mechanismen internalisieren. Caveolin hingegen ist für den intrazellulären Transport und die Inaktivierung des internalisierten Rezeptors wichtig (Manuskript in Vorbereitung). Insgesamt stellt die Arbeit einen biomathematischen Ansatz zur Beschreibung von Wachstumsfaktoren auf zelluläre Prozesse dar und liefert damit einen Beitrag zu dem sich im Entstehenden befindenden Gebiet der Systembiologie.

Translation of abstract (German)

In the here presented thesis we attempt the integration of experimental measurements with mathematical models of EGF Receptor endocytosis. Hereby we sought to describe both the internalization itself as well as subsequent endosomal sorting into clathrin-dependent or -independent pathways by quantitative experimental techniques and mathematical modeling. The EGF Receptor is mainly responsible for the transmission of growth factor signals. EGF Receptor endocytosis is interesting both from a biomedical as well as from a biomathematical viewpoint: The receptor as well as its associated signaling partners are powerful proto-oncogenes, associated with a variety of different cancers. Endocytosis and endocytic mis-sorting has emerged as a source of cellular transformation. One open problem is the uncertainty regarding existence of alternative endocytosis pathways and which adaptor molecules are involved in these. We describe a framework based on ow cytometry, confocal microscopy and mathematical modeling, to assess EGFR internalization in a high-precision, single-cell manner and discuss its application in screening for unknown components in the internalization machinery. In particular, we employed the hereby developed model to assess the effect of EGF receptor overexpression on the internalization process (H.S-G et al, accepted in JBC). Also from a biomathematical, systems-biology point of view the question of how the decision between different pathways is achieved is interesting. In the second part we present a mathematical model based on ordinary differential equations, which describes a 'switching mechanism' through which a continuous input signal is translated into an 'all or nothing' output ((H.S-G et al, BMC Systems Biology, 2008). The mathematical structure as well as the relevance for cell-biological processes is discussed in detail in the introduction. From the model we derive experimentally testable predictions, which we present in the third part of the thesis: Confocal microscopy was chosen as the principal tool to assess EGFR sorting into clathrin- or caveolin-dependent pathways. In order to evaluate the images in an objective manner, an imaging software was developed which allows the automated detection of vesicle features such as size, intensity and shape as well as the quantification of colocalization with endocytic proteins (manuscript submitted for publication). The main result of these experimental investigations is that the EGF receptor mainly internalizes via clathrin-dependent pathways. Caveolin instead is required for proper endocytic traffcking and inactivation of the receptor. Thus it plays an important role in signal control (manuscript in preparation). Taken together this work presents a biomathematical approach for the investigation of cell-biological processes, in particular the transduction of growth signals, and with this forms a contribution to the emerging field of systems biology.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 8 October 2008
Date Deposited: 21 Aug 2009 07:06
Date: 2008
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Biomathematik, Systembiologie, Signaltransduktion
Uncontrolled Keywords: EGFR , Endozytose , Mikroskopie , mathematische Modellierungmathematical modeling , EGFR
Additional Information: Teile in: Schmidt-Glenewinkel et al, BMC Systems Biology 2008; Schmidt-Glenewinkel et al, JBC 2009
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