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Erweiterung und Automatisierung eines hefebasierten Reportergen-Testsystems zur Detektion toxischer Potentiale

Walczak, Steffen

English Title: Extension and automatization of a yeast based reporter gene test system for detecting toxic potentials

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Abstract

Thema der vorliegenden Arbeit ist die Erweiterung und Automatisierung eines hefebasierten Reportergen-Testsystems zur Detektion toxischer Wirkungen. Die breite Erfassung biologischer und toxischer Wirkungen von Substanzen ist eine wichtige Aufgabe bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Neben der Bestätigung vorhergesagter Wirkmechanismen ist hier vor allem die Abschätzung des toxischen Potentials von zentraler Bedeutung, um mögliche Risiken erfassen zu können. Bereits in frühen Phasen der Wirkstoffentwicklung werden daher biologische Testverfahren benötigt, die mit geringen Kosten im Hochdurchsatz gefahren werden können. Diese müssen zuverlässige Ergebnisse liefern und sollten einen Rückschluß auf mögliche Wirkungen am Menschen ermöglichen,und den Ergebnissen von humanen Zellkulturuntersuchungen entsprechen. Ein solches Testsystem zur Detektion toxischer Potentiale im 96-well-Microplattenformat stellt das im Jahr 2000 von Afanassiev und Kollegen vorgestellte hefebasierte Reportergen-Testsystem dar. Auf Grund der Auswahl der Promotoren für das Reportergen-Plasmid von Genen, die durch DNA-Schäden induziert werden, ist dieses spezifisch für die Detektion genotoxischer Wirkungen geeignet. Um ein umfassenderes Bild der zellulären Wirkungen von Substanzen aufzuzeigen, wurden im Rahmen der Arbeit weitere Teststämme mit Promotoren anderer Spezifizität entwickelt. Eine weitere zentrale Aufgabe war die Etablierung und Optimierung des Testsystems auf einem Liquid-Handling-System zur automatisierten Durchführung von Substanztests im Hochdurchsatz. Ein erster Schritt für die Erweiterung des Testsystems war eine Umstellung vom 96-well-Microplatten-Format des bestehenden Tests auf das 384-well-Microplatten-Format. Dadurch konnten die für die Analyse erforderlichen Volumina um 60% reduziert werden, die erforderlichen Substanzmengen reduziert und die Anzahl der parallelen Messungen signifikant erhöht werden, bei gleichzeitiger Verringerung der Kosten um ca. 70%. Für die Etablierung neuer Reportergenkonstrukte und Teststämme wurden neue Gene / Promotoren zur Erweiterung des Testsystems durch Datenbank- und Literaturrecherche gesucht. Die Promotoren der ausgewählten Gene wurden mittels PCR aus genomischer DNA amplifiziert und durch molekulares Klonieren die entsprechenden Reportergen-Plasmide hergestellt. Diese wurden für die Transformation von Hefezellen (S. cerevisiae, FF18984) zur Herstellung von Reportergenstämmen genutzt. Ausgewählte Klone wurden mit Standardsubstanzen getestet und als Reportergenstämme für weitere Untersuchungen genutzt. Um dem wachsenden Umfang des Testsystems gerecht zu werden, wurde für Durchführung der experimentellen Untersuchungen die Nutzung eines Liquid-Handling-System notwendig. Dadurch konnte ein hoher Probendurchsatz bei großer Reproduzierbarkeit erreicht werden. Mit dem erweiterten hefebasierten Reportergen-Testsystem können Muster für die Proliferationshemmung und Promotor-Induktion der untersuchten Substanzen erstellt werden.Durch den Vergleich dieser Muster kann von Substanzen mit bekanntem, toxischem Potential auf das toxische Potential bislang nicht charakterisierter Substanzen geschlossen werden.In ersten Substanztests mit Standardsubstanzen, deren toxisches Potential weitgehend bekannt ist, und Organo-Metallkomplexen (ein Rhodium-Komplex und drei verschiedene Iridium-Komplexe) wurden erste Proliferationshemmungsmuster und Promotor-Induktionsmuster erstellt. Diese wurden genutzt, um das toxische Potential dieser bislang nicht weiter charakterisierten Substanzen im Vergleich mit den bekannten Referenzsubstanzen abzuschätzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß Kombinationen von Reportergenkonstrukten genutzt werden können, um mit vergleichsweise einfachen Experimenten Muster der zellulären Wirkungen von Substanzen zu erhalten, die eine (erste)Abschätzung toxischer Wirkungen von Substanzen ermöglichen.

Translation of abstract (English)

Topic of the presented thesis is the extension and automatization of a yeast based reporter gene test system for detecting toxic effects. In the development of new drugs, the comprehensive detection of biologic and toxic effects is an essential issue. Besides the confirmation of predicted biological activities, the estimation of the toxic potential is a central task in risk assessment during drug development. Therefore already in early stages of drug development biological test systems are required, which can be run in high throughput manner at low costs. They have to provide reliable results and should allow a conclusion of possible effects in humans and should correspond to results obtained with mammalian cell culture systems. The yeast based reporter gene test system in 96-wellmicroplate format, described by Afanassiev and colleagues in a publication from the year 2000, represents such kind of test system. Employing promotors of DNA-damage inducible genes, the test system specifically evaluates the genotoxic effects of substances. To monitor cellular effects of substances in a wider range, new test strains with promotors of distinct properties were created as a part of this work. Another central aim was to establish and optimize the test system on a liquid handling system to perform automated substance testings in a high-throughput manner. To enable larger scale analysis required for the extension of the test system, transposing the existing test system in 96-well-microplate format to the 384-well-microplate format was one of the first steps. Thereby volumes required for analysis could be 60 % reduced, furthermore a reduction of required amounts of substances and a significant increase of parallel measurements was achieved. Additionally costs were also reduced by 70% using the 384-well-format. For the preparation of new reportergene constructs and test strains, new genes / promotors were identified through a database and literature screen. Promotors of selected genes were amplified with PCR from genomic DNA and corresponding reportergene plasmids were produced by molecular cloning. New reportergene strains were created by transforming yeast cells of S.cerevisiae (FF18984) with these plasmids. Selected clones were tested with standard toxic substances and used for further substance testing as new reportergene strains. To accommodate the growing extent of the test system the use of a liquid handling system to perform experimental analysis became necessary. High throughput along with high reproducibility was achieved in this step.With the enlarged yeast based reporter gene test system proliferation inhibition patterns and promoter induction patterns can be generated. In comparing patterns compiled from standard substance testings with those of not yet characterized substances, the toxic potential of these substances can be assessed. Initial substance testings of standard substances with known toxic potential and new organo-metallic compounds (a rhodium complex and three different iridium complexes) were performed and proliferation inhibition patterns and promotor induction patterns for these new compounds were generated. To assess the toxic potential of these not yet further characterized substances these patterns were compared with those of reference substances. Within this thesis it could be shown that combinations of reportergene constructs can be used to create patterns of substance induced cellular effects which allow a (preliminary) evaluation of the toxic potential of substances.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Date of thesis defense: 22 June 2009
Date Deposited: 30 Jun 2009 12:42
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Toxizitätstest, High throughput screening, Grün fluoreszierendes Protein
Uncontrolled Keywords: Reportergen-Testsystem , yEGFP , Liquid Handling SystemReporter gene test system , Liquid Handling System
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