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Development of Universal Transmembrane Transporter Systems

Moosmeier, Markus Andreas

German Title: Entwicklung universeller Transmembran-Transportersysteme

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Abstract

Der Transport von Molekülen durch die Zellmembran stellt für die Entwicklung von intrazellulär aktiven Therapeutika eine große technische Herausforderung dar. Moleküle, z. B. Proteine, die aufgrund ihrer biophysikalischen Eigenschaften per se nicht in der Lage sind die Zellmembran zu durchdringen, können diese Fähigkeit durch ihre Kopplung an Proteintransduktionsdomänen (PTDs) erlangen. Die Fusion von PTDs kann jedoch zu reduzierten Ausbeuten während der Produktion und Reinigung, sowie zu veränderten biophysikalischen Eigenschaften von Proteinen führen. Daher wurden zwei neue Transportersysteme entwickelt, um nicht-modifizierte sowie modifizierte Moleküle durch die Zellmembran zu schleusen. Das erste Modellsystem wurde generiert, um Bindungsproteine einzuschleusen, die intrazelluläre Zielmoleküle spezifisch sequestrieren können. Als Modell für ein solches Bindungsprotein diente Streptavidin (SA), das mit Hilfe einer an den SA-Bindungsliganden Strep-tag II gekoppelten PTD in Säugerzellen eingeschleust wurde. Im Zytoplasma wurde der PTD-Strep-tag II-Ligand durch Biotin ersetzt, das im Vergleich zu Strep-tag II eine höhere Affinität für die SA-Bindetasche besitzt. Der erfolgreiche Austausch von PTD-Strep-tag II durch Biotin wurde durch Bestimmung der thermischen Tetramerstabilität von SA nachgewiesen, die nach Bindung von Biotin ansteigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass es prinzipiell möglich ist, intrazelluläre Moleküle spezifisch zu sequestrieren, die eine höhere Affinität zum Bindungsprotein aufweisen als der für die Internalisierung benutzte Ligand. Unter therapeutischen Gesichtspunkten ist es vorstellbar, entsprechende Systeme für die intrazelluläre Sequestrierung und funktionelle Inaktivierung pathologisch relevanter Faktoren einzusetzen. Ein zweites Transportsystem wurde entwickelt, um Moleküle in Zellen einzuschleusen, die im Gegensatz zu den eher „passiv“ wirksamen Bindungsproteinen eigene biochemische Aktivitäten aufweisen. Da eine kovalente Fusion von PTDs die funktionellen Eigenschaften von Molekülen beeinflussen kann, wurde ein besonderes Augenmerk darauf gelegt, Moleküle durch nicht-kovalente Kopplung an einen Transporter einzuschleusen. Hierfür wurden PTD-fusionierte SA- und Strep-Tactin-(ST-) Derivate, sog. „Transvidine“ und „Transtactine“, als Transporter für Biotin- und/oder Strep-tag II-gekoppelte Moleküle entwickelt. Durch Produktion der Transvidine und Transtactine als unlösliche bakterielle Einschlusskörper konnte das Problem der geringen Ausbeute während der Produktion und Reinigung umgangen werden, das für andere PTD-gekoppelte Proteine beobachtet wurde. Die biophysikalische Charakterisierung der Transvidin- und Transtactin-Transporter ergab hohe thermische Stabilitäten und stabile Sekundärstrukturen. Dies zeigte, dass sowohl SA als auch ST überaus rigide Proteingerüste darstellen. Zellkulturstudien zeigten, dass beide Transportersysteme Biotin- und/oder Strep-tag II-gekoppelte niedermolekulare Moleküle, Peptide, Proteine sowie multifaktorielle Komplexe einfach, sicher und effizient in humane Zellen internalisierten. Anhand des Modellproteins Meerrettichperoxidase wurde außerdem demonstriert, dass Proteine durch Transvidine und Transtactine in funktionell aktiver Form eingeschleust werden können. Diese Ergebnisse zeigen, dass Transvidine und Transtactine als universelle und effiziente Transportersysteme für die Internalisierung von Biotin- und Strep-tag II-gekoppelten Molekülen in Säugerzellen dienen können.

Translation of abstract (English)

The delivery of molecules into cells poses a major problem that has to be solved for the development of therapeutic agents acting on intracellular targets. Cargos which cannot penetrate cellular membranes by themselves due to their biophysical properties can achieve cell membrane permeability by fusion to protein transduction domains (PTDs). Since the design and generation of PTD-fused proteins can result in reduced expression and purification levels and/or in altered biophysical properties of cargos, two transporter systems for the transmembrane delivery of non-modified and modified cargos were developed. The first model system aimed at the internalization of a protein binder which can bind to, and subsequently sequester, an intracellular target molecule. Streptavidin (SA) was employed as a model protein binder and was internalized into mammalian cells via its ligand Strep-tag II, fused to a PTD. Inside the cells, the non-covalently bound PTD-Strep-tag II was displaced by biotin which exhibits a higher affinity to the SA binding pocket than Strep-tag II. Successful displacement of PTD-Strep-tag II was monitored by measuring the thermal tetramer stability of SA which is increased upon biotin binding. These results indicate that it is principally possible to intracellularly sequester target molecules with higher affinities for a protein binder than the PTD-ligand utilized for its internalization. Under therapeutic aspects, it could be envisioned to use such systems for the intracellular sequestration, and consequently, functional inactivation of pathologically relevant factors. A second transmembrane delivery system was developed for introducing cargos which themselves exert intrinsic biochemical activities, rather than acting as “passive” protein binders. Since covalent PTD fusion can influence cargo function, care was taken to introduce the cargos by non-covalent linkage to a transporter. PTD-fused SA and Strep-Tactin (ST) derivatives, termed Transvidins and Transtactins, were engineered as model transporters for biotin- and/or Strep-tag II-linked compounds. The expression of both transporters as insoluble inclusion bodies in bacteria prevented the common problems of both reduced expression levels and purification yields which have been observed for other PTD-fused proteins. Biochemical characterization of Transvidin and Transtactin variants bearing different PTDs revealed high thermal stabilities and robust secondary structures, indicating that SA and ST were extremely rigid protein scaffolds. Internalization studies demonstrated that both transporters facilitated simple, safe, and efficient transport of biotinylated and Strep-tag II-linked organics, peptides, proteins, and multicomponent complexes into cultured human cells. Transvidin- and Transtactin-introduced cargos were functionally active, as shown for the model protein horseradish peroxidase. These results demonstrate that Transvidin and Transtactin transporters provide universal and efficient delivery systems for biotinylated and Strep-tag II-fused cargos.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Zentgraf, Prof. Dr. Hanswalter
Date of thesis defense: 23 July 2009
Date Deposited: 23 Jul 2009 15:34
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Streptavidin, Internalisierung <Molekularbiologie>
Uncontrolled Keywords: Strep-Tactin , Strep-tag , ProteintransduktionsdomäneStreptavidin , Strep-Tactin , Strep-tag , Protein transduction domain , Internalization
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