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Dynamics of chromatin structure and nuclear multiprotein complexes investigated by quantitative fluorescence live cell microscopy and computational modeling

Kappel, Norman Constantin

German Title: Untersuchung der Dynamik von Chromatinstruktur und nukleären Multiproteinkomplexen mit quantitativer Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie und Computermodellen

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Abstract

Biology has rapidly been transformed into a mainly data-driven, quantitative science. Demands on biological imaging are moving towards quantitative annotations of genes in vivo. In this work I have studied in detail the spatio-temporal distribution and the molecular interaction of protein ensembles as well as of multiprotein aggregates. I have provided the methodology to estimate biophysical parameters such as diffusion coefficients, anomalous diffusion and the free fraction in the binding equilibrium of protein ensembles using fluorescence photobleaching analysis and numcerical modeling and parameter estimation. On the side of protein complexes I have extended existing single particle tracking approaches to allow to automatically detect the exact timing of mobility changes of single particles in live cells. Here, I was able to provide quantitative parameters also on the diffusion coefficient, anomalous diffusion, velocity and chromatin interaction. The nuclear protein ensemble I studied was murine linker histone H1° fused to GFP. I was able to show that diffusion and binding of H1°-GFP to chromatin can be addressed using photobleaching analysis and numcerical modeling. I have thus obtained diffusion coefficients for wild-type H1° and seven point mutants with differential binding affinity ranging from D = 0.01 mm²/s (strongest binder) to D = 0.1 mm²/s (weakest binder). Likewise, I was able to estimate the free fraction to range from = 400 ppm to = 3000 ppm. Exemplary of large multiprotein complexes I chose PML nuclear bodies (PML NBs), named after their constituent promyelotic leukemia protein. I studied in detail their dynamic mobility during early mitosis, ranging from prophase to prometaphase. A dramatic global increase in PML NB mobility was found during this period with the diffusion coefficient increasing from D = 0.001 mm²/s at interphase to D = 0.005 mm²/s at prophase. Similarly, velocities increased from v = 0.7 mm/min to v = 1.4mm/min and concomittant with a loss in subdiffusive motion. I was able to establish loss of tethering to chromatin as the most likely reason behind this increase as opposed to material flow or chromatin condensation. Lastly, I was also able to relate the timing of the mobility increase to other important cellular events. The increase of PML NB mobility predominantly occured after nuclear entry of cyclin B1, which irreversibly commits the cell to mitosis, and before nuclear envelope breakdown (NEBD).

Translation of abstract (German)

Die Biologie hat sich schnell in eine datengetriebene, quantitave Wissenschaft verwandelt. Die Anforderungen an die biologische Bildgebung bewegt sich daher in Richtung quantitativer Annotation von Genen in vivo.In dieser Dissertation habe ich die räumlich-zeitliche Verteilung, sowie deren molekulare Interaktionen von Proteinpopulationen wie auch von Multiproteinkomplexen untersucht. Ich habe Methoden entwickelt, mit denen man biophysikalische Parameter, wie Diffusionskoeffizienten, anomale Diffusion und das Bindungsgleichgewicht von Proteinpopulationen mit Hilfe von Fluoreszenzphotobleichen, numerischer Simulation und Parameterschätzung bestimmen kann. Bei der Analyse von Multiproteinkomplexen erweiterte ich bestehende Ansätze des Single-particle-tracking, um den exakten Zeitpunkt von Dynamikänderungen einzelner Partikel in lebenden Zellen automatisch detektieren zu können. Dabei ist es mir gelungen, quantitative Parameter, wie Diffusionskoeffizienten, anomale Diffusion, Geschwindigkeit und Chromatininteraktion zu bestimmen. Die nukleäre Proteinpopulation, die ich untersuchte, war das Linkerhiston H1° der Maus in Form von GFP-Konstrukten. Ich konnte zeigen, daß Diffusion und Bindung von H1°-GFP an Chromatin mit Fluoreszenzphotobleichen und numerischer Modellierung untersucht werden kann. Somit erhielt ich die Diffusionskoeffizienten von Wildtyp-H1°, sowie von sieben Punktmutanten mit jeweils unterschiedlicher Bindungsaffinität, die von D ca. 0.01 = mm²/s (höchste Affinität) bis D = 0.1 mm²/s (niedrigste Affinität) reichte. Außerdem konnte ich die nicht gebundene Fraktion abschätzen, die entsprechend von ca. 400 ppm bis ca. 3000 ppm reichte. Als Beispiel für große Multiproteinkomplexe wählte ich PML nuclear bodies (PML NBs), die nach ihrem Hauptbestandteil, dem Promyelotischen-Leukämie-Protein benannt sind. Ich untersuchte exakt deren dynamische Bewegung während der frühen Mitose, die von der Prophase bis zur Prometaphase reicht. Es konnte während dieses Zeitraums eine dramatische globale Zunahme in der Beweglichkeit der PML NBs festgestellt werden, bei der die Diffusionskonstante von D = 0.001 mm²/s während der Interphase auf D = 0.005 mm²/s während der Prophase ansteigt. In ähnlicher Weise erhöhten sich die Geschwindigkeiten von v = 0.7 mm/min auf v = 1.4 mm/min, was mit einer Abnahme in subdiffusiver Bewegung (also anomaler Diffusion) einher ging. Ich konnte zeigen, daß eine Loslösung von Chromatin die wahrscheinlichste Ursache für die Zunahme der Beweglichkeit darstellt im Gegensatz zu mechanischem Fluss von Nukleoplasma oder zu Chromatinverdichtung. Schließlich konnte ich die genaue zeitliche Abfolge der Beweglichkeitszunahme mit anderen zellulären Ereignissen in Verbindung bringen. So trat die Zunahme der Beweglichkeit von PML NBs hauptsächlich nach dem Eindringen von Zyklin B1 in den Zellkern auf, welches die Zelle unumkehrbar auf Mitose programmiert, sowie vor der Auflösung der Zellkernmembran.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Eils, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 3. July 2009
Date Deposited: 26. Aug 2009 13:33
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Zellbiologie, Zellkernstruktur, Zellkern, PML, Promyelotische Leukämie, Chromatin, Chromatinstruktur, Diffusionsmodell, Einzelpartikeltrackingcell biology, cell nucleus, nuclear architecture, nuclear structure, nuclear bodies, pml, chromatin, diffusion model, single particle tracking
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