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From a Phenotype to Transcriptomics Apomixis Initiation in the genus Boechera

Zielinski, Marie-Luise

German Title: Vom Phänotyp zur Transcriptomanalyse Apomixisinitiierung in der Gattung Boechera

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Abstract

The North American genus Boechera provides a highly polymorphic source of natural variation for studies on the regulation of apomictic development (asexual reproduction via seed). The aim of the research conducted was to qualify and quantify naturally-occurring reproductive variation in apomictic and sexual accessions (genotypes), and to further elucidate molecular factors responsible for the initiation of the first step in the apomictic pathway, apomeiosis. Sexual reproduction is characterized by double fertilization (i.e. a pair of sperm nuclei fertilize both the egg and central cell), whereby apomictic plants produce seeds without fertilization of the egg cell (yielding maternal genetic clones). In apomictic Boechera accessions the sexual pathway is altered for three traits: i) formation of an unreduced embryo sac, e.g. through meiotically-unreduced megaspore formation (apomeiosis), ii) development of an embryo from an unfertilized and unreduced egg cell (parthenogenesis), and iii) formation of functional endosperm (embryo nourishing tissue), e.g. fertilization of the binucleate central cell (pseudogamy). This type of apomixis is called “diplospory”. In general, apomixis is correlated with polyploidy. The genus Boechera contains one of the rare cases of diploid apomixis, and thus provides an ideal model whereby both diploid and polyploid apomicts can be compared. We began by examining both pollen and seed formation in a number of ecotypes in order to identify variation in the apomictic phenotype. Both apomicts showed flexibility with regards to combinations of the apomixis components, but diploid apomicts were characterized by higher flexibility to variant ploidy ratios in embryo : endosperm, which can affect seed development. In performing a comprehensive comparative study between reproduction traits of both apomictic karyotypes, I show that most traits exhibit lineage-specificity rather than correlations with ploidy. This could reflect the consequences of natural hybridization (we tested independently-evolved apomictic lineages), where natural selection acts upon novel variation in several traits to allow their establishment in specific niches, thus obscuring the effects of ploidy on reproductive success. The phenotypic data were used to select highly expressive diploid apomicts for a deep transcriptomic comparison between microdissected live sexual and apomeiotic ovules. This approach was taken to elucidate the first step in apomixis, apomeiosis, which is proposed to be the key factor for stable apomixis expression in Boechera. Approximately, 4 000 differentially expressed mRNAs were identified between sexual and apomictic ovules at the megaspore mother cell stage (MMC), the hypothesised stage of apomeiosis initiation, indicating : i) heterochronic expression of genes, ii) differential gene expression, and iii) a parent-of origin effect. In a following approach I preselected A. thaliana genes and performed a sequence homology search between Arabidopsis thaliana and Boechera. Identified sequences in Boechera were analysed with respect to their expression profiles generated from a SuperSAGE (serial analysis of gene expression) experiments. This study demonstrated that apomixis in Boechera might be influenced by chromatin remodelling, which could suppress or enhance gene transcription, and the cause for chromatin remodelling could be the heterozygous (i.e. hybrid) state of apomictic Boechera. This study yielded a set of promising apomixis initiation candidates, which could be used as a first subset for confirmation and functional studies. These data furthermore give deeper insight into the apomixis pathway and its complexity in the genus Boechera.

Translation of abstract (German)

Die nordamerikanische Gattung Boechera pflanzt sich entweder sexuell oder asexuell fort. Das natürliche Auftreten unterschiedlicher Fortpflanzungswege macht sie zu einem besonderem Model, um die Regulation des asexuellen Weges (bezeichnet als „Apomixis“) zu studieren. Die sexuelle Fortpflanzung ist durch den Prozess der Doppelbefruchtung (Eizelle und Zentralzelle werden jeweils durch ein Spermium befruchtet) charakterisiert. Hingegen produzieren apomiktische Pflanzen den Samen ohne die vorausgegangene Befruchtung der Eizelle (die Nachkommen sind genetische Klone). In apomiktischen Boechera Pflanzen wurde der sexuelle Prozess in drei Komponenten verändert: 1) die Herausbildung eines unreduzierten Embryosacks, durch die Umgehung der Meiose I während der Megasporenausbildung (apomeiosis), 2) die parthenogenetische Entwicklung der Eizelle zum Embryo (parthenogenesis) und 3) die Ausbildung von dazugehörigem Endospermgewebe durch Befruchtung der Zentralzelle (pseudogamy). Diese Form der Apomixis wird als Diplospory bezeichnet. In der Natur wird eine auffällige Korrelation von Apomixis mit Polyploidie vorgefunden. Die Gattung Boechera beherbergt den seltenen Umstand des gleichzeitigen Vorkommens von diploiden und triploiden Apomikten, das sie zu einem idealen Vergleichsmodel macht. Infolgedessen wurde die Pollen- und Samenausbildung von unterschiedlichen Boechera Akzessionen untersucht, um Variationen im apomiktischen Verlauf zu identifizieren. In beiden Karyotypen wurde Flexibilität in der Ausprägung von den drei Apomixiskomponenten festgestellt. Aber charakteristisch für diploide Apomikten war die höhere Anpassungsfähigkeit in Veränderungen der Ploidiebeziehung von Embryo und Endosperm. In einer umfassenden Studie, in der Reproduktionsmerkmale verglichen wurden, wurde vornehmlich eine Boechera Akzessionen-spezifische Ausprägung von Merkmalen herausgefunden. Dies läst auf keinen Vorteil von Apomixis im Zusammenhang mit Polyploidie schließen. Ein diskutierter Aspekt könnte die verfälschte Ausprägung der Merkmale auf Grund von Hybridisierung und der einhergehenden natürlichen Selektion auf neuartige Ausprägungen sein, die die Etablierung in Nischen ermöglicht. Die phänotypischen Daten wurden genutzt um, für eine weitreichende Transkriptomanalyse, stabile diploide apomiktische Pflanzen auszusuchen. Es wurden von zwei sexuell diploiden und zwei apomiktisch diploiden Pflanzen Samenanlagen herauspräpariert. Diese befanden sich am Eintritt zum Meioseprozess. Der Versuch wurde angelegt um in einer Gen – Expressionsanalyse (SuperSAGE; Serial Analyse of Gene Expression) molekulare Faktoren zu identifizieren, die bei der Initiierung von Apomixis (apomeiosis) von Bedeutung sind. In diesem Versuch wurden 4.000 differentiell exprimierte mRNAs zwischen den sexuellen und apomiktischen Samenanlagen identifiziert. Diese weisen hin auf i) Heterochronische Expression von Genen, ii) signifikant unterschiedliche Expression von Genen, und iii) ein Parent-of origin Effekt. Weiterhin wurde ein Sequenzähnlichkeitstest zwischen Gensequenzen von Arabidopsis thaliana und Boechera durchgeführt. Identifizierte Gene wurden in ihrem Expressionsverhalten studiert. Dabei wurden Hinweise gefunden, dass Apomixis in Boechera eventuell auf Umstrukturierungen des Chromatins zurückzuführen ist, welche durch den heterozygoten Zustand der Apomikten (Alloploide Hybriden) ausgelöst wurde. Mit diesem Versuch konnte eine Liste mit vielversprechenden Apomixis-Kandidaten aufgestellt werden, die für nachfolgende detaillierte Funktionsanalysen zur Verfügung stehen. Die gesammelten Daten geben einen tieferen Einblick in den Apomixis-Prozess von Boechera. Die nordamerikanische Gattung Boechera pflanzt sich entweder sexuell oder asexuell fort. Das natürliche Auftreten unterschiedlicher Fortpflanzungswege macht sie zu einem besonderem Model, um die Regulation des asexuellen Weges (bezeichnet als „Apomixis“) zu studieren. Die sexuelle Fortpflanzung ist durch den Prozess der Doppelbefruchtung (Eizelle und Zentralzelle werden jeweils durch ein Spermium befruchtet) charakterisiert. Hingegen produzieren apomiktische Pflanzen den Samen ohne die vorausgegangene Befruchtung der Eizelle (die Nachkommen sind genetische Klone). In apomiktischen Boechera Pflanzen wurde der sexuelle Prozess in drei Komponenten verändert: 1) die Herausbildung eines unreduzierten Embryosacks, durch die Umgehung der Meiose I während der Megasporenausbildung (apomeiosis), 2) die parthenogenetische Entwicklung der Eizelle zum Embryo (parthenogenesis) und 3) die Ausbildung von dazugehörigem Endospermgewebe durch Befruchtung der Zentralzelle (pseudogamy). Diese Form der Apomixis wird als Diplospory bezeichnet. In der Natur wird eine auffällige Korrelation von Apomixis mit Polyploidie vorgefunden. Die Gattung Boechera beherbergt den seltenen Umstand des gleichzeitigen Vorkommens von diploiden und triploiden Apomikten, das sie zu einem idealen Vergleichsmodel macht. Infolgedessen wurde die Pollen- und Samenausbildung von unterschiedlichen Boechera Akzessionen untersucht, um Variationen im apomiktischen Verlauf zu identifizieren. In beiden Karyotypen wurde Flexibilität in der Ausprägung von den drei Apomixiskomponenten festgestellt. Aber charakteristisch für diploide Apomikten war die höhere Anpassungsfähigkeit in Veränderungen der Ploidiebeziehung von Embryo und Endosperm. In einer umfassenden Studie, in der Reproduktionsmerkmale verglichen wurden, wurde vornehmlich eine Boechera Akzessionen-spezifische Ausprägung von Merkmalen herausgefunden. Dies läst auf keinen Vorteil von Apomixis im Zusammenhang mit Polyploidie schließen. Ein diskutierter Aspekt könnte die verfälschte Ausprägung der Merkmale auf Grund von Hybridisierung und der einhergehenden natürlichen Selektion auf neuartige Ausprägungen sein, die die Etablierung in Nischen ermöglicht. Die phänotypischen Daten wurden genutzt um, für eine weitreichende Transkriptomanalyse, stabile diploide apomiktische Pflanzen auszusuchen. Es wurden von zwei sexuell diploiden und zwei apomiktisch diploiden Pflanzen Samenanlagen herauspräpariert. Diese befanden sich am Eintritt zum Meioseprozess. Der Versuch wurde angelegt um in einer Gen – Expressionsanalyse (SuperSAGE; Serial Analyse of Gene Expression) molekulare Faktoren zu identifizieren, die bei der Initiierung von Apomixis (apomeiosis) von Bedeutung sind. In diesem Versuch wurden 4.000 differentiell exprimierte mRNAs zwischen den sexuellen und apomiktischen Samenanlagen identifiziert. Diese weisen hin auf i) Heterochronische Expression von Genen, ii) signifikant unterschiedliche Expression von Genen, und iii) ein Parent-of origin Effekt. Weiterhin wurde ein Sequenzähnlichkeitstest zwischen Gensequenzen von Arabidopsis thaliana und Boechera durchgeführt. Identifizierte Gene wurden in ihrem Expressionsverhalten studiert. Dabei wurden Hinweise gefunden, dass Apomixis in Boechera eventuell auf Umstrukturierungen des Chromatins zurückzuführen ist, welche durch den heterozygoten Zustand der Apomikten (Alloploide Hybriden) ausgelöst wurde. Mit diesem Versuch konnte eine Liste mit vielversprechenden Apomixis-Kandidaten aufgestellt werden, die für nachfolgende detaillierte Funktionsanalysen zur Verfügung stehen. Die gesammelten Daten geben einen tieferen Einblick in den Apomixis-Prozess von Boechera.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Koch, Prof. Dr. Marcus A.
Date of thesis defense: 18 September 2009
Date Deposited: 06 Oct 2009 15:04
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Service facilities > Uni-externe Einrichtungen
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Apomixis
Uncontrolled Keywords: Boechera , Hybridizierung , Polyploidie , Samenanlagenentwicklung , SAGEApomixis , polyploidy , hybridization , SAGE , gametophyte development
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