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Identifizierung und Charakterisierung kleiner nicht-kodierender RNA Moleküle aus dem Zellkern muriner Embryonaler Stammzellen und Embryonic Bodies

Scholl, Catharina

English Title: Identification and characterization of small nuclear non coding RNA from mouse embryonic stem cells and embryonic bodies

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PDF, German
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Abstract

In den vergangenen Jahren hat sich unser Verständnis von der funktionellen Diversität der RNA erheblich vergrößert. Besonders konnte eine große Anzahl nicht-kodierender RNA (ncRNA) Moleküle identifiziert werden, die entscheidende Schritte in der zellulären Differenzierung steuern. Angesichts der komplexen Natur der neuronalen Entwicklung wächst zunehmend die Erkenntnis, dass nicht-kodierende RNA eine bedeutende und bislang noch nicht aufgeklärte Rolle in der Kontrolle der zugrunde liegenden zellulären Differenzierungsprozesse spielen könnte. Zusätzlich zu ihrer Wichtigkeit für die neuronale Entwicklung könnte nicht-kodierende RNA auch an der Ausbildung neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt sein. Um neue nicht-kodierende RNA aufklären zu können, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wurde ein in vitro Modell der frühen neuronalen Differenzierung verwendet und aus zwei unterschiedlichen Differenzierungsstadien kleine nukleare RNA isoliert. Ausgehend vom Embryonalen Stammzellen (ES Zellen) der Maus wurden Spheroblasten acht Tage alter Embryonic Bodies (EBs) erzeugt. Aus beiden Entwicklungsstadien, ES Zellen und EBs, wurde RNA isoliert und dazu verwendet cDNA Bibliotheken aus kleiner nuklearer RNA herzustellen. Ein Aliquot der isolierten RNA wurde mittels in vitro Capping mit einer m7G-Cap-Struktur versehen. Hierdurch konnte ein spezifisches Muster der kleinen nuklearen RNA innerhalb der beiden Differenzierungsstadien aufgedeckt werden. RNA entsprechender Größe wurde dazu verwendet um cDNA Bibliotheken der beiden Entwicklungsstadien herzustellen. Insgesamt konnten 14 neue nukleare nicht-kodierende RNA Kandidaten in den beiden cDNA Bibliotheken identifiziert werden. Vier davon entfielen auf die cDNA Bibliothek aus ES Zellen, zehn auf die der EBs. Neun der neuen ncRNA Kandidaten Genen konnte in intronischen Bereichen des Genoms lokalisiert werden, nur zwei ncRNA Kandidaten konnten exonischen Regionen zugeordnet werden. Die Expression eines ncRNA Kandidaten (2-57) konnte im Northern Blot bestätigt werden. 2-57 zeigte eine ausgeprägte Expression vor allem in EBs und AtT-20 Zellen, während er in ES Zellen nicht exprimiert war. Neben den neuen ncRNA Kandidaten wurden auch bekannte ncRNAs, die in den cDNA Bibliotheken nachgewiesen werden konnten, auf ihre Expression untersucht. Pre-mi-690 und Y3 scRNA zeigten hierbei eine geregelte Expression in den beiden untersuchten Dif-ferenzierungsstadien. Beide waren in EBs schwächer exprimiert, als in ES Zellen und den untersuchte Zelllinien.

Translation of abstract (English)

In recent years our understanding of the functional diversity of RNA has expanded widely. In particular a wide range of non-protein-coding RNA molecules were identified that regulate crucial steps in cellular differentiation. Given the complex nature of neuronal development there is a growing awareness that non-coding RNA may play a more pronounced, yet unexplored role in the control of the underlying cellular differentiation processes. In addition to being important for neuronal development, non-coding RNA may also contribute to the de¬velopment of neuro-degenerative diseases. To screen for new non-coding RNA that may be involved in these processes we used an in vitro model for early neuronal differentiation and isolated small nuclear RNA from two distinct cellular differentiation stages. Starting from mouse embryonic stem cells (mES), spheroblasts of 8 day old embryonic bodies (EBs) were generated. RNA from both mES and EBs were isolated and used to create cDNA libraries of small nuclear RNA. An aliquot of the iso¬lated RNA was in vitro capped, revealing two distinct patterns of small nuclear RNA of the two differentiation stages. RNAs of corresponding size were used to create cDNA libraries from both cell stages. In total, we identified 14 novel nuclear non coding RNA (ncRNA) candidates, four from mES cells and 10 from EBs. Of the candidate ncRNA genes, 9 mapped to introns, while only two mapped to exonic regions. The expression of one candidate ncRNAs (2-57) could be confirmed by northern blot analysis. 2-57 showed a pronounced expression in EBs and AtT-20 cells, but not in mES cells. Beside the new ncRNA candidates the expression of known ncRNA molecules, which were identified in the cDNA libraries, were analysed. Pre-miR-690 and Y3 scRNA showed a distinct expression within the two stages of differentiation. Both were weakly expressed in EBs, but showed a strong expression in mES cells and the other analysed cell lines.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Date of thesis defense: 22 September 2009
Date Deposited: 08 Apr 2010 08:17
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Small nuclear RNA, Non-coding RNA, Embryonale Stammzelle, Differenzierung
Uncontrolled Keywords: Embryonic BodiesEmbryonic Bodies , ES Cells , Differentiation
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