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Charakterisierung des Guaninnukleotid-Austauschfaktors p63RhoGEF als neuen Mediator der Galphaq/11-induzierten RhoA-Aktivierung

Vettel, Christiane

English Title: Characterization of the guanine nucleotid exchange factor p63RhoGEF as a new mediator of the Galphaq/11-induced RhoA activation

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Abstract

Monomere GTPasen der Rho-Familie spielen als zentrale Mediatoren eine entscheidende Rolle bei der Regulation multipler zellulärer Prozesse, wie der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts, der Genexpression, Proliferation, Migration und Apoptose. Bis heute ist jedoch nur wenig über die unmittelbar beteiligten akzessorischen Proteine und Signalübertragungswege bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Funktion des neu identifizierten, Galphaq/11-spezifischen Guaninnukleotid-Austauschfaktors (GEF) p63RhoGEF näher zu charakterisieren, zu untersuchen ob er an der RhoA-Aktivierung in kardialen Primärzellen der Ratte beteiligt ist und welche Bedeutung er bei der Entwicklung einer zellulären Hypertrophie in isolierten Kardiomyozyten hat. Zunächst wurden die biochemischen Eigenschaften von p63RhoGEF im Vergleich zum Leukemia-associated RhoGEF (LARG), das ebenfalls als Gq/11-reguliert beschrieben war, analysiert. Für beide GEFs konnte die Aktivierung über Galphaq/11-Proteine bestätigt werden, wobei unterschiedliche Mechanismen dieser Aktivierung zu Grunde liegen. Während für die Aktivierung von LARG, zusäztlich zur Bereitstellung von aktiviertem Galphaq/11, ein direkter Kontakt des GEFs mit dem Agonist-gebunden Gq/11PCR benötigt wird, ist für die Stimulation von p63RhoGEF eine direkte Interaktion mit aktivierten Proteinen der Galphaq/11-Familie ausreichend. Wie durch Analyse der Kristallstruktur von p63RhoGEF und Punktmutationen gezeigt, umfasst dabei die Kernregion der Bindung den C-terminalen Bereich der PH-Domäne („PH-Extension“) und wird zusätzlich durch einzelne Aminosäuren innerhalb der DH- und der PH-Domäne stabilisiert. Vergleichbare Charakteristika zeigen auch die beiden p63RhoGEF-Homologe Kalirin/Duet und Trio, so dass die drei GEFs zu einer neuen Dbl-Unterfamilie zusammengefasst werden können, die sich entwicklungsbiologisch von einem schon in Invertebraten (z.B. Unc73 in C.elegans) vorhanden Vetreter dieser Familie ableiten. Die Stimulation isolierter Kardiomyozyten der neonatalen Ratte (NRCM) mit Phenylephrin (PE) und Endothelin-1 (ET-1) induzierte eine partiell über Galphaq/11-vermittelte Aktivierung von RhoA. Im Gegensatz zu PE, führte dabei die ET-1-induzierte RhoA-Aktivierung zur Stressfaserbildung und dem Aufbau sarkomerer Strukturen, wobei der Galphaq/11-abhängige Anteil über p63RhoGEF vermittelt wurde. Klassische Hypertrophie-Indikatoren (verstärkte Proteinsynthese, Expression von Markerproteinen) zeigten keine Abhängigkeit von p63RhoGEF bzw. RhoA, sondern wurden über den Galphaq/11-Effektor PLCß sowie die monomere GTPase Rac1 reguliert. Die Stimulation von isolierten kardialen Fibroblasten mit Angiotensin II induzierte eine RhoA-Aktivierung, die selektiv über den Angiotensin II–Rezeptoren-Typ I - Galphaq/11 - p63RhoGEF-Signalweg erfolgte. Die Daten belegen eine Galphaq/11-p63RhoGEF-vermittelte RhoA-Aktivierung sowohl in Kardiomyozyten als auch in kardialen Fibroblasten. Da Angiotensin II ein wichtiger Mediator der pathologischen Fibrose im Herzen ist, könnte dieser Signalweg von pathophysiologischer Bedeutung sein.

Translation of abstract (English)

Momomeric GTPases of the Rho-family play an essential role as central mediators in the regulation of multiple cellular processes such as the reorganization of the actin-cytoskeleton, gene expression, proliferation, migration and apoptosis. To date, little is known about directly involved associated proteins or signal transduction pathways. Therefore this work aimed to characterize the function of the recently identified, Galphaq/11 -specific guanine nucleotide exchange factor (GEF) p63RhoGEF, to analyze whether it is involved in the activation of RhoA in rat primary cardiac cells and to evaluate its relevance in the development of cellular hypertrophy in isolated cardiomyocytes. First, the biochemical properties of p63RhoGEF were analyzed in comparison to leukemia associated RhoGEF (LARG), which had also been described as Galphaq/11 –regulated GEF. Although the activation by Galphaq/11 -proteins could be confirmed for both GEFs, the underlying mechanisms of this activation proved to be different. The activation of LARG is, apart from the presence of activated Galphaq/11, additionally dependent on a direct contact between LARG and the agonist-bound Galphaq/11PCR. In contrast, the direct interaction with activated Galphaq/11-proteins was sufficient for the stimulation of p63RhoGEF. Analysis of the crystal structure of p63RhoGEF and point mutations revealed the core region of the binding site comprises the C-terminal part of the PH-domain (“PH-extension”). Stabilization by discrete amino acids within the PH- and DH-domain is however additionally required. As p63RhoGEF and its homologues Kalirin/Duet and Trio exhibited similar characteristics, all three GEFs can be categorized as a new Dbl-subfamily originating from one member already present in invertebrates (e.g. Unc-73 in C.elegans). The stimulation of isolated neonatal rat cardiomyocytes (NRCM) with penylephrine (PE) or endothelin-1 (ET-1) induced a partially Galphaq/11-dependent activation of RhoA. Contrary to PE, ET-1-induced RhoA-activation led to the formation of stress fibres and the assembly of sarcomeric structures. The Galphaq/11-dependent part in these processes was mediated by p63RhoGEF. The induction of classical indicators of hypertrophy (enhanced protein synthesis, expression of marker proteins) was not dependent on p63RhoGEF or RhoA activation, but was regulated by the Galphaq/11-effector PLCß and the monomeric GTPase Rac1. The stimulation of isolated cardiac fibroblasts with angiotensin II induced an activation of RhoA, which was selectively mediated by the angiotensin II-receptor-type I – Galphaq/11– p63RhoGEF-signalling pathway. The data proves a Galphaq/11-p63RhoGEF-mediated RhoA-activation in cardiomyocytes as well as in cardiac fibroblasts. As Angiotensin II is an important mediator of the pathological fibrosis in the heart a pathophysiological relevance of this pathway can be anticipated.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 15. July 2009
Date Deposited: 29. Sep 2009 11:17
Date: 2009
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Institut für Exp. u. Klin. Pharmakologie und Toxikologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Signaltransduktion, G-Proteine, Herzhypertrophie
Uncontrolled Keywords: RhoGEFRhoGEF
Additional Information: Teile in: Structure of Gaq-p63RhoGEF-RhoA Complex Reveals a Pathway for the Activation of RhoA by GPCRs, Science 2007, 318: 1923-1927
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