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Studies on the Chemical Biology of Natural and Chemical Ribonucleotide Modifications

Seidu-Larry, Salifu

German Title: Untersuchungen zur Chemischen Biologie von natürlichen und chemischen Ribonukleotidmodifikationen

English Title:

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Abstract

This work is centered on the synthesis and chemical recognition of modified RNA. Phosphoramidites of m5U, Ψ, m1G, m2G and m22G were synthesized and were incorporated into RNA oligomers by standard SPS. The synthesized oligomers were used for two purposes: (i) the total construction of tRNA via enzyme catalyzed ligation, and (ii) investigations of modifications in siRNAs. The construction of human mitochondrial tRNAIle (i) with and without modification was achieved in a one-pot 3 fragments ligation using T4-DNA-ligase with a DNA-splint. The yield for the ligation was 20-30 % and the products were further investigated for the stability of the tertiary structure via UV-melting curve analysis. The unmodified tRNA was found to be significantly less stable than the fully modified tRNA. In the second case (ii) RNAi efficiency and the immunostimulation in cells were investigated with 22 nucleotide long double-stranded siRNAs that were synthesized containing the modifications m1G, m2G, m22G, rT and  in varying stochiometry. The investigations showed differential effects in knock-down as well as immunostimulation. In a related perspective, compounds for the chemical recognition of modifications in RNA were synthesized. Since the recognition of pseudouridine by 4-bromomethyl-coumarin derivates is of particular interest, 7-azido-4-bromomethyl-coumarin was obtained with an overall yield of 44 % in a 5-step synthesis. Another derivative, the biotinylated 4-bromomethyl-coumarin spaced with jeffamine-148 was obtained in a 6-step synthesis with an overall yield of 17 %, to allow the use of strepavidin for affinity separation. In the course of further investigations of coumarine conjugates, mild and bio-compatible conditions for the syntheses of rhodols and rhodamines were discovered. The conversion of fluorescein into the 3’-mesylated or 3’-6’-dimesylated derivate and the subsequent displacement of the mesylate with a nitrogenous nucleophile gave rise to rhodols or rhodamines, respectively. As these reaction conditions are compatible with biomolecular labeling, the tagging of polypeptides was investigated. Tri-and pentapeptides were synthesized, and dye-labeled via 3’/6’-xanthene substitution, and the product identity confirmed by MALDI-TOF-MS. Further syntheses via 3’/6’-xanthene substitution lead to moderate yields of 3',6'-bis(dimethylamino)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-one, 3',6'-di(piperidin-1-yl)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-one and the 3',6'-bis(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl amino)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-one.

Translation of abstract (German)

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen die Synthese und chemische Erkennung von modifizierter RNA. Die Phosphoramidite von m5U, Ψ, m1G, m2G und m22G wurden synthetisiert und mittels Standard-Festphasensynthese in RNA-Oligonukleotide inkorporiert. Die synthetisierten RNA Oligomere wurden für zwei Zwecke verwendet: (i) die Totalsynthese von tRNA mittels enzymkatalysierter Ligation und (ii) Untersuchungen zu Modifikationen in siRNAs. Die Synthese von humaner mitochondrialer tRNAIle (i) mit und ohne Modifikationen wurde in einer Eintopfligation von drei Fragmenten durch T4-DNA-Ligase mit einem DNA-Splint erzielt. Die Ausbeuten lagen zwischen 20-30 %. Die Produkte wurden durch UV-Schmelzkurvenanalyse auf Stabilität der Tertiärstrukturen untersucht. Hierbei zeigte sich, dass modifizierte tRNA signifikant stabiler als die unveränderte tRNA war. Im zweiten Fall, (ii) wurden RNAi Effizienz und zelluläre Immunstimulation von, doppelsträngigen siRNAs (22 Nukleotide) untersucht, welche mit den Modifikationen m5U, Ψ, m1G, m2G und m22G in unterschiedlicher Stöchiometrie synthetisiert worden waren. Die Untersuchungen zeigten differenzierte Effekte in Knock-Down und Immunostimulation. Vor diesem Hintergrund wurden Verbindungen zur chemischen Erkennung von Modifikationen in RNA synthetisiert. Weil der Erkennung von Pseudouridin durch Derivate von 4-Brommethylcumarin eine besondere Bedeutung zukommt, wurde 7-Azid-4-brommethyl-coumarin mit einer Gesamtausbeute von 44 % in einer fünfstufigen Synthese erhalten. Ein weiteres Derivat wurde in einer sechsstufigen Synthese mit einer Gesamtausbeute von 17 % erhalten. Dieses biotinylierte 4-Brommethylcumarin, welches ein Jeffamine-148 als Abstandshalter enthält, ist für den Gebrauch in der Affinitätsreinigung mittels Streptavidin einsatzbereit. Während weiterer Untersuchungen zu Konjugaten von Cumarinen wurden schonende und bio-kompatible Bedingungen für die Synthesen von Rhodolen und Rhodaminen entdeckt. Die Umwandlung von Fluorescein in 3’-mesylierte beziehungsweise 3’-6’-dimesylierte Derivate, gefolgt von einer nukleophilen Substitution der Mesylate durch Stickstoffnukleophile führte zu Rhodolen beziehungsweise Rhodaminen. Da sich diese Bedingungen als kompatibel mit der Markierung von Biomolekülen erwiesen, wurden Konjugationsreaktionen mit Peptiden untersucht. Tri- und die Pentapeptide wurden synthetisiert, per 3’/6’-Xanthen-Substitution markiert, und die Identität der Produkte wurde durch MALDI-TOF-MS bestätigt. Weitere Untersuchungen zur 3’/6’-Xanthen-Substitution führten zu Synthesen von 3',6'-Bis(dimethylamino)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-on, 3',6'-Di(piperidin-1-yl)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-on und 3',6'-Bis(2-(2-(2-aminoethoxy)ethoxy)ethyl amino)-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthen]-3-on in moderaten Ausbeuten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jäschke, Prof. Dr. Andres
Date of thesis defense: 9. July 2009
Date Deposited: 13. Oct 2009 10:08
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Oligoribonucleotide, Nucleotide, Abbaureaktion
Uncontrolled Keywords: Natural modifcations , chemical modifications , chemical biology
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