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Colon cancer chemopreventive potential of apple juice and apple polyphenols in the APC Min/+ model

Garreta Rufas, Antonio

German Title: Das chemopräventive Potential von Apfelsaft und Apfel-Polyphenole im Darmkrebs Mausmodel APC Min/+

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Abstract

Colorectal cancer is the second and third most leading cancer in Europe and the US, respectively. One of the main risk factors of this malignancy of the large bowel has been associated to western-style diets rich in high saturated fat and meat and low in fiber. During the last years, it has been reported that a regular uptake of fruits and vegetables may reduce the incidence of colorectal cancer. One of the most consumed fruits in western diet patterns are apples. Several epidemiological and case-control studies have indicated that usual consumption of one or more apples a day may reduce the risk for colon cancer. But so far, the possible preventive effects of apple juice have not been completely investigated. Our previous examinations showed that polyphenolic extracts from apple juice are biologically active in terms of radical scavenging, influence on drug metabolism as well as anti-inflammatory and anti-hormonal potential in vitro. Moreover, we used the colorectal chemoprevention Apc Min/+ mouse model to study the chemopreventive effect of apple juices. This strain is highly susceptible to spontaneous intestinal adenoma formation. The results showed that cloudy apple juice and polyphenolic apple juice extract had a significant impact diminishing the tumor development in the small intestine of Apc Min/+ mice. However, the possible mechanism remained to be understood. In the present study, the possible molecular mechanism was investigated in a second animal experiment. Animals were treated with water (as a control), cloudy apple juice (CAJ), placebo juice (apple juice without polyphenols), 0.2% B-PAE (procyanidin-rich apple extract) and a combination between cloudy apple juice and 0.2% B-PAE. Both cloudy apple juice and B-PAE intervention significantly reduced adenoma development by 24% and 34%, respectively. These findings indicated polyphenols as the main chemopreventive compounds in this model. On the other hand, placebo juice and cloudy apple juice plus B-PAE treatments, inhibited intestinal adenomas in a nonsignificant manner by 7% and 17%, respectively. Moreover, placebo juice intervention enhanced small adenomas in the whole small intestine. In the liver, cloudy apple juice- and cloudy apple juice plus B-PAE-treated animals resulted in an induction of Phase II enzymes (GST, QR, and TrxR). Further investigations identified a high concentration of polyphenol metabolites in the urine of animals treated with cloudy apple juice and cloudy apple juice plus B-PAE. This indicated that polyphenol metabolites may reach the liver after intestinal absorption. However, due to an overnight fasting prior to dissection, the protein content of liver cells of mice in the water and B-PAE intervention groups was disminished. Several enzymatic activies such as CYP1A1, QR and TrxR were decreased as a result of this fasting effect. In contrast, placebo juice, CAJ and CAJ + B-PAE maintained hepatic protein contents due to the carbohydrate uptake from these drinks. The possible mechanism of the development of adenomas was investigated using protein array technology. Proteomic analysis revealed that fasting effects increased phosphorylated ERK and the target iNOS in intestinal adenomas. Similarly, Cyclin D1 was reduced but only in the middle parts of the small intestine. B-PAE treatments reduced fasting associated effects by decreasing p-ERK, iNOS, and Cyclin D1. Since only very low concentrations of metabolites of polyphenols were found in urine and in analogy to other comparable compounds, a direct passage into the intestine or hepato-biliary excretion can be assumed. Therefore these results might be attributed to procyanidins acting locally. CAJ and B-PAE treatments did not affect inflammation markers such as nitric oxide content in urine or PGE2 in serum. In vivo levels of apple polyphenols were not high enough to efficiently inhibit these inflammation markers. Cyclin D1 was strongly reduced in the distal parts of the small intestine by CAJ and CAJ + B-PAE. As well as in a non-significant manner, beta-catenin was reduced in a similar way. Overall, apple polyphenols from CAJ and B-PAE reduced adenoma development in the Apc Min/+ mouse model. This chemopreventive potential was dependent on the intestinal bioavailability. Control animals (12 h fasted) resulted in an increase of Erk phosphorylation and of iNOS expression. B-PAE-treated animals suppressed these fasting-associated effects compared to water controls as well as in the groups that had access to high-calorie apple juice.

Translation of abstract (German)

Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Krebsart in Europa, in den USA die dritthäufigste. Als ein Hauptrisikofaktor gilt die westliche Ernährung, die reich an gesättigten Fettsäuren und Fleisch sowie arm an Ballaststoffen ist. Im Laufe der Zeitzeigte sich, dass ein regelmäßiger Verzehr von Obst und Gemüse die Tumorinzidenz senken kann. Eine der am häufigsten konsumierten Früchte in der westlichen Ernährung ist der Apfel. Verschiedene epidemiologische Studien sowie Fallkontrollstudien haben gezeigt, dass der regelmäßige Verzehr von einem oder mehr Äpfeln täglich das Risiko,an kolorektalem Karzinom zu erkranken, senken kann. Ein möglicher präventiver Effekt von Apfelsaft wurde bisher jedoch nicht vollständig untersucht. Unsere vorangehenden Untersuchungen zeigten in vitro folgende biologischen Aktivitäten von Polyphenol-Extrakt aus Apfelsaft: Radikalfänger-Eigenschaften, Beeinflussung des Fremdstoffmetabolismus sowie antiinflammatorisches und antihormonelles Potential. Darüber hinaus untersuchten wir den chemopräventiven Effekt von Apfelsaft am ApcMin/+ Maus Modell für kolorektale Chemoprävention. Dieser Stamm entwickelt spontan in hohem Maße intestinale Adenome. Die Ergebnisse zeigten, dass trüber Apfelsaft und Apfel - Polyphenol - Extrakt signifikant die Tumorentstehung im Dünndarm der ApcMin/+ Maus hemmen. Dieser Mechanismus konnte bisher jedoch nicht vollständig geklärt werden. In der aktuellen Studie wurde der mögliche molekulare Mechanismus in einem zweiten Tierversuch erforscht. Die Tiere erhielten Wasser (Kontrollgruppe), naturtrüben Apfelsaft, Placebo-Apfelsaft (Apfelsaft ohne Polyphenole), 0.2% B-PAE (procyanidinreicher Apfelsaftextrakt) und eine Mischung aus trübem Apfelsaft und 0.2% B-PAE. Sowohl die Gabe von Trübsaft als auch die von B-PAE reduzierten signifikant die Neubildung von Adenomen um 24% bzw. 34%. Dieser Befund kennzeichnet die Polyphenole als vorrangige chemopräventive Bestandteile dieses Modells. Placebo-Saft und die Mischung aus Trübsaft und 0,2% B-PAE hemmten die Adenomentwicklung lediglich im nicht signifikanten Bereich (7% bzw. 17%). Die Zufuhr von Placebo-Saft erhöhte sogar die Bildung von kleinen Adenomen im gesamten Dünndarm. In der Leber zeigte sich bei den mit Trübsaft und den mit dem Gemisch aus Trübsaft und B-PAE behandelten Tieren eine Induktion von Phase II Enzymen (GST, QR und TrxR. Weitere Untersuchungen zeigten eine hohe Konzentration an Polyphenolmetaboliten im Urin der Tiere dieser Gruppen. Dies weist darauf hin, dass Polyphenolmetabolite nach Resorption im Darm in die Leber gelangen. Durch Fasten über Nacht vor der Sektion war jedoch der Proteingehalt in der Leber in der Kontrollgruppe (Wasser) sowie der B-PAE Gruppe vermindert. Auch die Aktivität verschiedener Enzyme wie z.B. CYP1A1, QR and TrxR sank in Folge des Fastens.Im Gegensatz dazu blieb in den anderen Gruppen (Placebo–Saft, trüber Apfelsaft und trüber Apfelsaft mit B-PAE) auf Grund der Kohlehydratzufuhr durch diese Säfte der Proteingehalt in der Leber stabil. Der mögliche Mechanismus des Adenomwachstums wurde mit Hilfe von Protein arrays untersucht. Proteomische Untersuchungen zeigten, dass Fasten die Phosphorylierung von ERK und die Expression des Zielproteins iNOS bei Darmadenomen steigerte. In ähnlicher Weise wurde Cyclin D1 reduziert, jedoch nur im mittleren Teil des Dünndarms. Die Behandlung mit B-PAE reduzierte fasten-assoziierte Effekte durch Abnahme von p-ERK, iNOS und Cyclin D1. Da kaum nachweisbare Konzentrationen von Polyphenol–metaboliten im Urin gefunden wurden, kann auch in Analogie zu vergleichbaren Substanzen eine direkte passage in den Dünndarm oder eine hepato-biliäre Exkretion angenommen werden. Somit können diese Ergebnisse möglicherweise einer lokalen Wirkung von Procyanidinen zugeschrieben werden. Entzündungsparameter wie der Stickoxydgehalt im Urin oder PGE2 im Serum wurden durch Trübsaft und B-PAE nicht beeinflusst. Die in vivo–Spiegel der Apfelpolyphenole reichten nicht aus, um diese effektiv zu hemmen. Cyclin D1 wurde durch Trübsaft und Trübsaft gemischt mit B-PAE in distalen Anteilen des Dünndarms stark reduziert. Wenn auch nicht signifikant, so wurde β–catenin in ähnlicher Weise reduziert. Zusammenfassend kann man sagen, dass Apfel-Polyphenole aus trübem Apfelsaft und B-PAE das Adenomwachstum im ApcMin/+ Maus Modell hemmten. Das chemopräventive Potential war abhängig von der intestinalen Bioverfügbarkeit. Erhalten die Tiere aussliesslich wasser (12 Std nüchtern) war die phosphorylierung bzw. expression von Erk und iNOS erhöht. Erhalten die Tiere B-PAE, waren diese Fasten-assoziierten Effekte reduziert im Vergleich zur Waserkontrolle, wie auch in den Gruppen, die Zugang zu hochkalorischen Apfelsaft hatten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Date of thesis defense: 3. November 2009
Date Deposited: 05. Nov 2009 10:22
Date: 2009
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Colon cancer , apple juice , polyphenols , Apc Min mice , procyandins , chemoprevention
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