German Title: Regulatorische Architektur des Fgf8 Locus und gewebsspezifische Kontrolle von Genexpression

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Abstract

During vertebrate development, precise spatio-temporal expression of genes is necessary for growth and tissue differentiation in the embryo. These genes are usually controlled by multiple elements scattered hundreds of kilobases up- and downstream of a target gene, sometimes embedded in introns of functionally non-related genes. This intricate distribution along the chromosome raises the question on the importance of the regulatory architecture for correct gene expression. This is additionally emphasized by several genetic disorders where no mutations in coding regions were found. Instead, it seems they are associated with the disruption of the normal structure of chromosomal domains. Furthermore, distribution of genes and their regulatory elements is mostly conserved across distant species, suggesting they are organized following a specific architecture. To address the role of structural organization of genes and their regulatory elements in achieving proper gene expression, we studied TLX1-FGF8 interval mapped to human chromosome 10q24. This 600kb gene-rich region harbors seven functionally and phylogenetically unrelated genes, representing a “normal” genomic situation. Gene order of the whole region is extremely conserved in tetrapods and to some extent in teleosts and beyond. In addition, human condition split hand-foot malformation type 3 (SHFM3), characterized by the loss of central digits on hand and feet, is caused by 0.5Mb tandem duplication within this locus. FGF8 is coding for a signaling molecule involved in developmental processes, including limb development. Although FGF8 is not within the duplicated interval, the early termination of its expression in the apical ectodermal ridge (AER) contributes to the phenotype. Despite the earlier mapping attempts conducted in mice and fish, full scope of Fgf8 regulatory elements is not determined. Combining mouse transgenesis and chromosomal engineering, I narrowed down the region critical for Fgf8 expression spanning 200kb downstream of the gene. Within it, I characterized individual regulatory elements. Many of them guided the expression of LacZ reporter gene in overlapping domains, suggesting functional redundancy. Also, when tested individually, they express much more regulatory potential than is eventually utilized by Fgf8. Additional experiments using artificial chromosomes (BACs) with inserted LacZ revealed filtering of this potential when elements are in their natural genomic environment. Fine-tuning of regulatory potential can be achieved either by negative elements or the structure of the locus itself. Close proximity of Fgf8 enhancers and promoters of other genes in the region raised the question on how do regulatory elements discriminate between their target and promoters of genes nearby. A series of chromosomal rearrangements reallocating different promoters into Fgf8 regulatory region showed that Fgf8 enhancers are intrinsically capable to activate heterologous promoters and that enhancer-promoter specificity is not exclusively guided by the sequence of the promoter. Rather, the relative position of the two plays a significant role in achieving proper target gene activation. Based on the results of our study, we propose a novel concept of gene regulation: a holo-enhancer. Within a holo-enhancer, vast regulatory potential of multiple enhancers is filtered by their relative position towards the target gene and the activity of potential negative regulators. Also, individual enhancers are able to activate heterologous promoters. However, this intrinsic promiscuity is refined by their position-dependent activity. In a complex genomic environment like the one of Fgf8, gene regulation is not composed of simple binary promoter-enhancer interactions, but is embedded in the structure of the region itself. Once a holo-enhancer is divided into individual elements, their full potential is revealed and perturbations of the region show the potential of enhancers to act on other promoters. This novel concept emphasizes the holistic nature of the interactions of genes and their regulatory elements in achieving gene and tissue specificity, with the overall organization of the locus being a key aspect in this process. These observations led us to suggest the mechanism leading to SHFM3. Duplication breakpoints disrupt the holo-enhancer, reallocating part of the enhancers and releasing them from potential negative elements needed to refine their activities. In addition, a new position brings them to the appropriate distance to heterologous promoters. Their intrinsic promiscuity and broad regulatory potential allows activation of other genes in the region, potentially leading to their up-regulation. Moreover, complex interactions within this region could also explain ancient linkage between functionally unrelated genes (like Fgf8 and Fbxw4), which is most probably due to structural constraints of the regulatory scaffold upon which genes are transcribed.

Translation of abstract (German)

Die Entwicklung von Vertebraten benötigt räumlich und zeitlich exakt kontrollierte Genexpressionsmuster, die das Wachstum Gewebsdifferenzierung gewährleisten. Diese Gene werden meist durch mehrere regulative Elemente gesteuert, die über einige hundert Kilobasen um das Zielgen verstreut sein und manchmal in Intronen funktional nicht verwandter Gene liegen können. Die komplexe und evolutionär konservierte Verteilung der Elemente lässt die Frage nach einer spezifischen „regulativen Architektur“ in der Genexpression aufkommen. Diese Architektur scheint sehr wichtig für die korrekte Expression vieler Gene zu sein, da viele humangenetische Erkrankungen nicht auf Mutationen in kodierenden Sequenzen, sondern auf strukturelle Veränderungen chromosomaler Domänen zurückzuführen sind. Um die Existenz einer möglichen regulativen Architektur in der Verteilung von Genen und regulativer Elemente zu klären, haben wir uns entschlossen den Locus 10q24 zu untersuchen. Diese etwa 600kb große, genreiche Region beinhaltet sieben funktional und phylogenetisch nicht verwandte Gene und bietet somit eine repräsentative, genomische Umgebung für die Studie. Sie ist zwischen Tetrapoden besonders und bis zu Teleostier weitgehend konserviert. Weiterhin ist der TLX1-FGF8 Locus relevant für Humangenetiker, da eine 0,5Mb Tandemduplikation in dieser Region ursächlich für die humane Spalthand und -Fuß Malformation 3 (SHFM3) ist. FGF8 kodiert ein Signalmolekül, welches an einer Vielzahl von entwicklungsbiologischen Prozessen wie der Extremitätenentwicklung beteiligt ist. Obwohl FGF8 selbst nicht von der Duplikation betroffen ist, spielt die vorzeitige Terminierung seiner Expression in der Extremitätenknospe bei der Entwicklung des Phänotyps eine wichtige Rolle. In den Modellorganismen Maus und Fisch wurden in früheren Studien schon Fgf8 regulierende Elemente entdeckt, aber das gesamte Ausmaß nie systematisch untersucht. Mittels Maus Transgenese und Chromosomen Engineering konnte ich die zur Fgf8 Expression wichtige Region auf 200kb unterhalb des Genes eingrenzen. Innerhalb dieser Region habe ich regulative Elemente charakterisiert, die die Expression eines LacZ Reporter Genes in überlappenden Fgf8 Domänen steuerna und die daher funktional redundant zu sein scheinen. Weiterhin zeigten die individuellen Elemente ein weit höheres regulatives Potential als die Fgf8 Expression vermuten ließe. Allerdings wird dieses überschüssige Potential entweder durch negative Elemente oder die Struktur des Locus in der natürlichen genomischen Umgebung unterdrückt, welches ich durch Experimente mit BACs zeigen konnte. Ein zentraler Punkt in der Forschung von Genregulation ist die Frage, wie regulative Elemente zwischen ihrem Zielpromoter und anderen, zum Teil näher liegenden Promotern unterscheiden können. Durch Umgestaltung des Fgf8 Locus mittels Chromosomen Engineering konnte ich zeigen, dass Fgf8 Enhancer heterologe Promotoren aktivieren können und daher die Enhancer-Promoter Spezifität nicht ausschließlich Sequenz-abhängig sein kann. Sie scheint eher von der relativen Positionierung zueinander und der Struktur des gesamten Locus abzuhängen. Aufgrund der Ergebnisse dieser Studie schlagen wir ein neues Konzept der Genregulation vor, in dem ein gesamtes Intervall als „Holoenhancer“ agiert. Innerhalb eines Holoenhancers wird das regulative Potential mehrer Elemente über andere, negative Elemente und durch ihre relative Position zum Zielgen gefiltert. Weiterhin können individuelle Elemente heterologe Promotoren aktivieren, wobei allerdings die Möglichkeit der unspezifischen Interaktion durch ihre positionsabhängige Aktivität verhindert wird. In einer komplexen genomischen Umgebung wird die Genregulation nicht durch einfache Interaktionen von Promotoren mit einzelnen regulativen Elementen gesteuert, sondern ist in der umliegenen Struktur eingebettet. Dies wird deutlich, wenn der Holoenhancer in die einzelnen Elemente aufgeteilt wird und dadurch das volle regulative Potential offenkundig wird. Das neue Konzept unterstreicht die ganzheitliche Natur der Interaktion von Genen mit ihren regulativen Elementen. Diese ist nötig um Gen- und Gewebsspezifität zu gewährleisten, wobei der strukturellen Organisation des Locus eine Schlüsselrolle zukommt. Die Hypothese kann auch zur Klärung der Entstehung der SHFM3 beim Menschen herangezogen werden. Die Bruchpunkte der Duplikation zerstören die Integrität des Holoenhancers und verteilen einen Teil der regulativen Elemente um. Dadurch werden diese von mutmaßlichen negativen Elementen getrennt und in die entsprechende Distanz zu heterologen Promotern gebracht. So könnten Gene in FGF8 Domänen ektop exprimiert werden und somit den dominant-negativen Phänotyp auslösen. Die Notwendigkeit für eine definierte räumliche Struktur regulativer Elemente erklärt möglicherweise auch den evolutionären Druck für die alten Kopplungen von funktional unterschiedlichen Genen, die im Falle von Fgf8 und Fbxw4 bis zu den Weichkorallen konserviert ist.