English Title: Identification of target genes of the transcription factor Foxp1 during brain development

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Abstract

Das Gen FOXP1 kodiert für ein Forkhead BoxTranskriptionsfaktor. Heterozygote Mutationen im FOXP1-Gen, die beim Menschen zu einer Haploinsuffizienz führen, rufen verschiedene kognitive Phänotypen hervor. Die Patienten leiden an geistiger Behinderung, einer Sprachentwicklungsstörung und in manchen Fällen an Autismus. Daher ist anzunehmen, dass FOXP1 während der Gehirnentwicklung und bei kognitiven Prozessen eine wichtige Rolle spielt. Jedoch ist bis heute wenig über die Rolle von FOXP1 im Gehirn bekannt. Daher war die Zielsetzung dieser Arbeit, Zielgene von Foxp1 während der embryonalen Gehirnentwicklung zu identifizieren und zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe von zwei genomweiten Screening-Ansätzen potentielle Zielgene von Foxp1 identifiziert. In einem ersten Ansatz wurde die Expression humaner SH-SY5Y Neuroblastomazellen mit und ohne FOXP1-Knockdown in Microarray-Studien verglichen. Aus diesem Screening ging PCDH17 als Zielgen von FOXP1 hervor. Die Aktivierung der Expression von PCDH17 konnte zudem durch qPCR-Experimente in den murinen Neuroblastomazellen N1E-115 und in embryonalen Gehirnen der konditionellen Foxp1 -/- Mauslinie bestätigt werden. Weitere qPCR-Studien zeigten, dass diese transkriptionelle Regulation von E13 bis E16 stattfindet. Am Entwicklungstag E16 war diese Aktivierung im Cortex, Striatum, Hippocampus und Thalamus zu beobachten. Eine direkte Bindung von Foxp1 ca. 8 kb upstream vor dem Transkriptionsstart von Pcdh17, konnte in ChIP-Experimenten nachgewiesen werden. Chrna4 wurde in einem weiteren Microarray-Screening, mit RNA von wt- und KO-Vorderhirnen der konditionellen Foxp1 -/- Mauslinie des Entwicklungtages E16, als Zielgen identifiziert. qPCR-Experimente bestätigten diese transkriptionelle Regulation am Entwicklungstag E15 und E16 im Vorderhirn von Mausembryonen. Zudem konnte diese Repression in Zellkulturexperimenten mit murinen N1E-115- und humanen SH-SY5Y-Zellen bestätigt werden. Weitere Studien mit RNA der Foxp1 -/- Mauslinie zeigten, dass eine Repression von Chrna4 durch Foxp1 am Tag E16 im Thalamus stattfindet. Immunfluoreszenz-Färbungen zeigten, dass Chrna4 bei fehlender Foxp1-Expression auch in Neuronen exprimiert ist, in denen im wt- Gehirn Foxp1, aber nicht Chrna4 exprimiert ist. Durchgeführte ChIP-Experimente zeigten, dass Foxp1 direkt an den Promotor von Chrna4 bindet. Beide identifizierten Zielgene, Pcdh17 und Chrna4, sind im embryonalen Gehirn in Arealen exprimiert, die in neuronale Kreisläufe involviert sind, welche für diverse kognitive Prozesse, wie beispielsweise der Sprachentwicklung, essentiell sind. Pcdh17 ist ein Zelladhäsionsprotein und Chrna4 kodiert für eine Untereinheit neuronaler Acetylcholinrezeptoren. Somit sind beide Proteine wichtig für die Signalübertragung am synaptischen Spalt. Aus veröffentlichten Studien ist bekannt, dass bei Patienten mit geistiger Behinderung und Autismus häufig Gene betroffen sind, die für synaptische Proteine kodieren. Somit ist es möglich, dass die Fehlregulationen von PCDH17 und CHRNA4, in den Gehirnen von Patienten mit Mutationen im FOXP1-Gen, zu dem kognitiven Phänotyp beitragen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente identifizierten damit die ersten bekannten Zielgene von Foxp1 im Gehirn und tragen zur Aufklärung der molekularen Rolle von Foxp1 während der Gehirnentwicklung bei.

Translation of abstract (English)

The transcription factor Foxp1 is a member of the Fox gene family. Heterozygous mutations affecting the FOXP1 gene, causing haploinsufficiency, lead to a broad cognitive phenotype. These patients suffer from intellectual disability, a significant impairment of speech and language abilities and autism spectrum disorder. This suggests an important role for FOXP1 in brain development and normal cognitive function. However, the role of FOXP1 in brain development remains to be investigated. To address this, the goal of my PhD thesis was to identify and analyse target genes of Foxp1 during brain development. To uncover target genes of Foxp1 in brain development, whole genome microarray experiments were carried out. In a first approach, I compared gene expression in SH-SY5Y neuroblastoma cells with reduced FOXP1 expression to cells with a normal level of FOXP1 expression. This screening uncovered PCDH17 as a potential target gene. To further validate this target, knockdown studies in the murine neuroblastoma cell line N1E-115 were carried out. In addition, forebrain RNA from E13, E15 and E16 embryos from a conditional Foxp1 -/- mouse were isolated and used for qPCR experiments. All experiments confirmed the transcriptional regulation of Pcdh17 by Foxp1. At E16 this activation takes place in the hippocampus, thalamus, cortex and the striatum. A direct binding of Foxp1 about 8 kb upstream of the transcriptional start site of Pcdh17 was demonstrated by ChIP experiments. Chrna4 was identified as a target gene of Foxp1 in a microarray screen with RNA isolated from E16 forebrain of the conditional Foxp1 -/- mouse. Additional qPCR studies of E15 and E16 Foxp1 -/- forebrains confirmed this transcriptional repression of Chrna4 by Foxp1. In vitro experiments in N1E-115 and SH-SY5Y cells affirmed the repression of Chrna4 by Foxp1. Immunofluorescence studies showed that the expression of Chrna4 is broader in the thalamus of E16 KO embryos. Moreover, this broader expression was observed in neurons expressing Foxp1, but not Chrna4 in wt embryos. Further qPCR studies demonstrated a transcriptional repression of Chrna4 by Foxp1 in the thalamus. ChIP experiments revealed a direct binding of Foxp1 4 kb upstream of the transcriptional start site of Chrna4. The data show that Pcdh17 and Chrna4 are expressed in the embryonic brain during development. Both target genes are expressed in brain regions which are involved in neuronal circuits regulating diverse cognitive processes, including speech and language. Pcdh17 is a cell adhesion molecule and Chrna4 is an acetylcholine receptor subunit. Both proteins are important for the signal transduction at the synaptic cleft. Causitive mutations leading to intellectual disability and autism spectrum disorder are often found in genes coding for synaptic proteins. Thus it is possible that the misregulation of PCDH17 and CHRNA4 in the brains of patients with a FOXP1 haploinsufficiency may contribute to the cognitive phenotype. This thesis has identified the first target genes of Foxp1 in the brain and Pcdh17 and Chrna4 may be useful candidates for understanding the role of Foxp1 in brain development.