Englische Übersetzung des Titels: Two-Hybrid Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy : In vivo Characterization of Protein- Protein Interactions in the AP-1 System

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Abstract

In dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen den AP-1-Komponenten c-Fos und c-Jun mit der so genannten �Zwei-Hybrid�-Fluoreszenzkreuzkorrelations-spektroskopie in vivo nachgewiesen. Des Weiteren wurden die Mobilität und die Dynamik dieses Komplexes in lebenden Zellen charakterisiert. AP-1 (Aktivator Protein-1) ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Komponenten nur als Dimere ihre Funktion ausüben können, wobei c-Jun und c-Fos die Hauptkomponenten sind. Mit der FCCS können Wechselwirkungen zweier Fluorophore aufgrund ihrer korrelierten Bewegung nachgewiesen werden. Das Prinzip der FCCS beruht auf der gleichzeitigen Anregung und Detektion zweier Fluorophore in einem konfokalen Mikroskopaufbau. Die Intensitätsfluktuationen in beiden Kanälen werden über Kreuz korreliert. Zur Kreuzkorrelation tragen nur Teilchen bei, die in beiden Kanälen gleichzeitig ein Signal erzeugen, d.h. die beide Farben simultan durch das Beobachtungsvolumen tragen. In der �Zwei-Hybrid�-FCCS werden als Fluorophore ausschließlich autofluoreszierende Proteine (AFP) statt organisch-chemischer Farbstoffe eingesetzt. Dies hat den großen Vorteil, dass die Proteine nicht aufgereinigt, dann chemisch markiert und schließlich in die Zelle mikroinjiziert werden müssen, sondern direkt von der Zelle als Fusionsprotein in vivo exprimiert werden und ohne weitere Eingriffe in die Zelle gemessen werden können. Unter den getesteten AFPs (EYFP, ECFP, EGFP, DsRed2, mRFP1 und eqFP611) war das Chromophorpaar EGFP-mRFP1 das einzige, das zum Erfolg führte. Der FCCS-Aufbau wurde in vivo einerseits mit einem Fusionsprotein aus EGFP und mRFP1 als Referenz für 100 % Kreuzkorrelation und andererseits mit den zwei über einen IRES-Vektor getrennt exprimierten EGFP und mRFP1 als Negativkontrolle für fehlende Wechselwirkung kalibriert. Es wurden Fusionsproteine von c-Jun und mRFP1 bzw. c-Fos und EGFP, sowie von deren Deletionsmutanten c-JunDD und c-FosDD, denen die Dimerisierungs- und DNA-Bindungsdomäne fehlte, hergestellt. Während die AP-1 Deletionsmutanten eine Kreuzkorrelationsamplitude von 18 % ± 4 % lieferten, vergleichbar mit der Negativkontrolle von 13 % ± 3 %, zeigte das AP-1-System eine signifikante Kreuzkorrelationsamplitude von 31 % ± 6 %. Im Vergleich dazu lieferte die Positivkontrolle, das Fusionsprotein aus EGFP und mRFP1, eine Amplitude von 45 % ± 4 %. Außerdem zeigte das AP-1-System nur eine langsam diffundierende Komponente, was darauf schließen lässt, dass alle markierten Fos-Jun Dimere an DNA gebunden sind. So konnte mit der �Zwei-Hybrid�-FCCS sowohl die Wechselwirkung zwischen c-Jun und c-Fos als auch die Bindung dieses Komplexes an DNA nachgewiesen werden. Diese Methode eignet sich somit sehr gut, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu charakterisieren.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

In this work the interactions between the AP-1 components c-Fos and c-Jun were characterised in vivo by the use of �Two-Hybrid�-Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (THFCCS). Furthermore the mobility and dynamics of the AP-1 complex were studied. AP-1 (Activator Protein-1) is a transcription factor, which is known to exert its function as a dimer, whereby c-Fos and c-Jun are the major components. Interactions between two fluorophores can be detected via Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy (FCCS) by their correlated motion. The principle of FCCS is based upon the simultaneous excitation and detection of two fluorophores in an confocal microscope setup. The fluctuations of the intensity in both channels are cross-correlated. Only particles that induce a signal in both channels simultaneously contribute to the cross-correlation function. In THFCCS, autofluorescent proteins (AFPs) instead of small organic dyes are used. This way, the interaction partners do not need to be purified, chemically labeled and microinjected into the cell. The AFPs were directly expressed as a fusion protein by the cells in their natural environment. Among the tested AFPs (EYFP, ECFP, EGFP, DsRed2, mRFP1 and eqFP611) only the chromophore pair EGFP-mRFP1 gave satisfactory cross-correlation signals upon protein-protein binding. The FCCS setup was calibrated in vivo on one hand with a fusion construct of EGFP and mRFP1 as reference for 100 % cross-correlation and on the other with the two separate proteins EGFP and mRFP1 as a negative control. In addition, fusion proteins of c-Jun and mRFP1 and c-Fos and EGFP as well as of their deletion mutants, which had the dimerisation and DNA-binding domains removed, were constructed. While the cross-correlation amplitude for the deletion constructs (18 % ± 4 %) was at the background level of 13 % ± 3 %, cells that expressed the full-length protein showed an increased cross-correlation amplitude of 31 % ± 6 %. The cross-correlation amplitude of the EGFP-mRFP1 fusion construct was 45 % ± 4 %. Furthermore the cross-correlation function of the Fos-Jun complex shows only a slowly decaying component, indicating that all dimers are bound to DNA. With this technique the interactions between c-Jun and c-Fos as well as the binding of their complex could be shown in living cells. It is conceivable that the THFCCS combined with a scanning system could be applied to screen protein-protein interactions.