Englische Übersetzung des Titels: DNA Sequencing by Single-Molecule Hydrolysis

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Abstract

Das Ziel der Einzelmolekülexperimente in dieser Arbeit ist, Lösungen auf dem Weg zu einer Einzelmolekül-DNS-Sequenzierung zu finden. Zunächst wird die Frage nach der Ausdehnung des Detektionsvolumens in Relation zur Kapillare mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie beantwortet. Dazu wird eine Theorie der FCS mit einem ellipsoid-gaussförmigen Detektions-volumen unter der Randbedingung zylindrischer, undurchdringbarer Wände abgeleitet. Die entwickelte Modellfunktion wird gemessenen Korrelationskurven angepaßt. Das Ergebnis ist, daß die Detektionsempfindlichkeit am oberen und unteren Kapillarrand auf etwa 68 %, an den seitlichen Kapillarrändern auf 19 % des Maximalwertes abgefallen ist. Bei den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen Cy5 und Mr121 ist es mit der entwickelten Ereigniserkennungssoftware demnach möglich, mehr als 99 % der aus der Kapillare austretenden Moleküle zu erfassen. Dank des niedrigen Untergrundsignals und der Rauschunterdrückung durch geeignete Filter ist die Zählrate falsch-positiver Ereignisse mit 7,9E-19 Hz vernachlässigbar. Es wurde ein Verfahren zur elektrophoretischen Selektion einzelner DNS-Stränge erprobt. Die Sequenzierversuche an Modelloligonucleotiden, statistisch markierten PCR-Produkten und an an zwei Basen vollständig markierter DNS ergab mittlere Schneideraten von E. coli-Exonuclease I am Einzelmolekül von 280 Hz bei 3,6 % Markierungsdichte und 3 Hz bei 50 % Markierungsdichte. Es konnte auf einem 99,75 %-Signifikanzniveau nachgewiesen werden, daß die gemessene Sequenz Information aus der abgebauten Sequenz enthält, die erreichte Leselänge betrug 31 Basen. In der vorliegenden Arbeit konnten wichtige Ergebnisse auf dem Weg zur Einzelmolekülsequenzierung erzielt werden, die Steigerung der Leselänge bleibt aber ein wichtiger Bestandteil zukünftiger Forschung.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

The aim of the single-molecule experiments described in this thesis is to develop techniques which enable single-molecule-DNA-sequencing. The first task accomplished was to compare the dimensions of the detection volume with those of the capillary. A theory of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) in microcapillaries intersected by a gaussian detection volume has been derived. Fitting the model fuction to measured FCS-curves revealed that the detection efficiency has decreased to 68 % at the vertical and to 19 % at the horizontal fringes of the capillary. It is possible to detect more than 99 % of the dyes (Mr121 and Cy5) leaving the capillary. As the background signal is low, the count rate of false positive events (7,9E-19 Hz) is negligible. A method for electrophoretic single molecule handling has been demonstrated. Single molecule sequencing experiments with model-oligonucleotides, statistically labeled PCR-products and completely labeled (at C and U) DNA showed cleavage rates of E. Coli Exonuclease I of 280 Hz at 3,6 % label-density and 3 Hz at 50 % label-density. It has been shown with 99,75 % significance, that the measured sequence contains information of the sequence of the degraded DNA. The reading length achieved was 31 bases. Important advances towards single molecule DNA sequencing were achieved in the thesis presented. Improving the reading length remains an important task to future research.