Deutsche Übersetzung des Titels: Funktionelle und strukturelle Untersuchungen des Coatomer Komplexes

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Abstract

In my PhD thesis I have investigated molecular mechanisms in the biogenesis of membrane vesicles. Formation of transport vesicles involves polymerization of cytoplasmic coat proteins. In COPI vesicle biogenesis, the heptameric complex coatomer is recruited to donor membranes by the interaction of multiple coatomer subunits with the budding machinery. Specific binding to the trunk domain of coatomer's subunit gamma-COP of the Golgi membrane protein p23 induces a conformational change in the gamma-subunit, leading to polymerization of the complex in vitro. Using a combination of biochemical assays and an assay based on single-molecule, singlepair fluorescence resonance energy transfer, we find that this conformational change is only induced by dimers of the p24-family proteins p23 and p24, and neither by the other p24-family members nor by cargo proteins. This conformational change takes place in individual coatomer complexes, independent of each other, and the rearrangement induced in gamma-COP is transmitted within the complex to its alpha-subunit. Alpha-COP is one of coatomer's subunits capable of binding to dibasic cargo motifs, and also shows analogy to the Clathrin molecule. We propose a model in which capture of membrane protein machinery triggers cage formation in the COPI system. At the nanometer resolution I started investigating the structure of the lattice of conformationally changed coatomer on COPI vesicles generated in vitro from purified Golgi membranes and coating machinery, using cryo electron tomography. Initial data on coated vesicles and coated buds is presented.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

In meiner Doktorarbeit habe ich die molekularen Mechanismen der Biogenese von COPIVesikeln untersucht. Der Transport von Proteinen und Membranen in einer eukaryotischen Zelle erfolgt über vesikuläre Träger. Zur Bildung dieser Vesikel polymerisieren Hüllproteine, die sowohl in einer löslichen, cytosolischen Form als auch in einer membrangebundenen Form vorliegen. In der Biogenese eines COPI Vesikels bindet der heptamere Hüllkomplex Coatomer an die Donormemrbanen über multiple Interaktionen mit der Maschinerie zur Abknospung der Vesikel. Die Interaktion der gamma-Untereinheit von Coatomer (gamma-COP) mit dem transmembran-Protein p23 induziert einen Konformationswechsel in gamma-COP, der zur Polymerisation des Komplexes in vitro führt. In dieser Arbeit wurden biochemische und biophysikalische Methoden verwendet, um diesen Konformationswechsel in Coatomer zu untersuchen. Dabei wurde ein Verfahren zur Untersuchung der Konformation individueller Coatomer-Komplexe mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer etabliert. Der beschriebene Konformationswechsel in gamma-COP wird nur durch dimere der Proteine p23 und p24 induziert, und nicht durch andere Mitglieder der p24-Familie oder Frachtproteine. Er findet in einzelnen Coatomer-Komplexen statt, und wird in die periphere Untereinheit alpha-COP weitergeleitet. Alpha-COP ist eine der beiden Untereinheiten von Coatomer, die Frachtmoleküle mit dibasischen Signalsequenzen binden; zudem zeigt alpha-COP Analogien zu Clathrin über alpha-solenoide und beta-Propeller-Domänen. In dieser Arbeit wird ein Modell vorgeschlagen, in dem die Bindung von spezifischen Transmembranproteinen die Polymerisierung der Hüllproteine und die Ausbildung der COPIVesikelhülle induziert. In einem zweiten Projekt wurde die Struktur von Coatomer in der COPI-Hülle auf in vitro generierten COPI Vesikeln durch cryo Elektronenmikroskopie und Tomographie untersucht. Erste tomographische Rekonstruktionen von Vesikeln und COPI-Knospen an Donormembranen werden gezeigt.