German Title: Regulation der transkriptionellen Aktivität von GAbp unter pro-inflammatorischen Bedingungen

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Abstract

Eine systemische Entzündungsreaktion tritt häufig bei einer progressiven Krebserkrankung auf. Die auf den Entzündungsreiz hin aktivierte Immunantwort ist außer Kontrolle geraten und führt zur gravierenden Ausschüttung an proinflammatorischen Zytokinen, z.B. TNF-alpha. Diese dyfunktionale Immunreaktion führt zur Beeinträchtigung von bis dato gesunden Organen, wie z.B. dem Skelettmuskel. Die dem Prozeß der Muskelatrophie zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind insbesondere auf transkriptioneller Ebene weitestgehend unbekannt. Aus diesem Grund wurde ein zellbasierter Screen im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt, um jene transkriptionelle Regulatoren zu identifizieren, deren Aktivität sich unter atrophischen Bedingungen verändert. Eine Behandlung von HEK293T Zellen mit TNF-alpha führte zu einer deutlichen Erniedrigung der transkriptionellen Aktivität der DNA-bindenden Komponente des Ets Transkriptions Faktors GAbp, GAbpalpha. Die für die transkriptionelle Aktivität notwendige funktionale Interaktion von GAbpalpha mit der zweiten GAbp Untereinheit, GAbpbeta, war in TNF-alpha behandelten C2C12 Zellen, einer murinen Muskelzelllinie, ebenfalls signifikant reduziert. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die Dissoziation des transkriptionell aktiven Heterodimers lediglich die minimalen Bindedomänen von GAbpalpha und GAbpbeta benötigt, für TNF-alpha spezifisch ist und über eine intrazellulären Anhäufung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) erfolgt. Im Muskel wird die Aktivität von GAbp durch den Wachstumsfaktor Neuregulin (NRG) erhöht und führt zur Expression von sub-synaptischen Genen (z.B. epsilon Untereinheit des Acetylcholin-Rezeptors (AChRepsilon), welche für die Innervation des Muskels durch motorische Nervenzellen unerläßlich sind. Die NRG-abhängige Aktivierung des AChRepsilon-Promotors als auch der AChRepsilon-mRNA Expression wurde in Gegenwart von TNF-alpha signifikant eingeschränkt, wobei diese Effekte spezifisch für TNF-alpha waren und über ROS erfolgten. Zudem war die Expression von sub-synaptischen GAbp Zielgenen in einem Mausmodel entzündlicher Tumorkachexie inhibiert. Eine pro-inflammatorische Stimulation von Muskelzellen führt über intrazellulär aktivierte ROS zur Erniedrigung der transkriptionellen Aktivität von GAbp. Die daraus resultierende reduzierte Genexpression von sub-synaptischen GAbp Zielgenen könnte zur Denervation des Muskels führen und somit wesentlich zur Muskelatrophie im Kontext systemischer Entzündungsreaktionen oder des Alterungsprozesses beitragen.

Translation of abstract (English)

Cancer and the Metabolic Syndrome are debilitating human diseases being accompanied by a dysregulated immune response frequently resulting in systemic inflammatory processes. Circulating pro-inflammatory cytokines (e.g. TNF-alpha) target metabolic tissues, like skeletal muscle - a process leading to muscle atrophy. The molecular mechanisms of the underlying transcriptional control still remain elusive. Therefore, the identification of transcriptional regulators with altered transcriptional activity in response to atrophic conditions was addressed in this study. In a cell-based high-throughput screen, the transcriptional activity of GAbpalpha, the DNA-binding component of the Ets transcription factor GAbp, significantly decreased upon TNF-alpha treatment. Subsequent analysis in the murine muscle cell line C2C12 revealed that reactive oxygen species (ROS) mediate TNF-alpha-dependet dissociation of GAbpalpha and GAbpbeta, the transcriptional activation domain component of GAbp. This alteration of GAbp complex interaction was specific to TNF-alpha, and the minimal binding domains of GAbpalpha and GAbpbeta were sufficient for TNF-alpha mediated dissociation. Moreover, TNF-alpha efficiently blocked the neuregulin growth factor (NRG) mediated activation of a GAbpalpha the DNA consensus motif of GAbpalpha, thus suggesting that dissociation of the transcriptional active GAbp heterodimer is implicated in GAbp target gene expression. This was further supported by the finding that NRG-induced expression of the sub-synaptic GAbp target gene, epsilon subunit of the acetylcholine receptor (AChRepsilon), was restraint specifically by TNF-alpha. ROS inhibitors efficiently rescued this altered gene expression of AChRepsilon; under pro-inflammatory conditions. Taken together, formation of ROS links pro-inflammatory TNF-alpha signalling in muscle cells to GAbp complex dissociation and thereby decreases the transcriptional activity of GAbp. This altered activity leads to decreased gene expression of GAbp subsynaptic target genes; thus, suggesting that accumulation of ROS under atrophic conditions may lead to denervation of muscle cells causing muscle atrophy.