English Title: Identification and characterisation of MEGAP interaction partners

Preview

PDF, German Download (5MB) | Terms of use

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde nach bisher unbekannten Interaktionspartnern für das mit geistiger Behinderung assoziierte Protein MEGAP gesucht. MEGAP/srGAP3 ist ein Mitglied der Slit-Robo GAP (srGAP) Familie und an der Slit/Robo-vermittelten repulsiven Wegfindung von Axonen und neuronalen Migration beteiligt. Durch die Inhibierung der kleinen Rho-GTPase Rac1 und der Interaktion mit WAVE-1 inhibiert MEGAP die Aktinpolymerisation. Um die funktionelle Korrelation der Assoziationen zwischen MEGAP, dem Slit-Rezeptor Robo1 sowie weiteren MEGAP-Interaktionspartnern zu verstehen, wurde zu Beginn dieser Arbeit das Expressionsmuster der Megap und Robo1 mRNA in verschiedenen Entwicklungsstadien der murinen Embryonalentwicklung untersucht. Die Expressionsstudien haben gezeigt, dass Megap in vielen Bereichen des sich entwickelnden Nervensystems exprimiert wird. Die Expression des Megap Transkripts wird bereits sehr früh (vor E9.5 p.c.) initiiert und konnte verstärkt in den stammzellreichen Regionen des Gehirns, im Neuralrohr, im neuronalen Gewebe des optischen Systems sowie in diversen Ganglien detektiert werden. Für die Suche nach MEGAP-Interaktionspartnern wurden ein Yeast-Two-Hybrid Screen sowie GST-Pulldown Experimente durchgeführt. Im Rahmen des Yeast-Two-Hybrid Screens mit einem C-terminalen MEGAP-Fragment und einer humanen fötalen Gehirn cDNA-Bibliothek wurde das nukleäre Protein Periphilin als putativer Interaktionspartner isoliert. Die Bindung von MEGAP an Periphilin über die MEGAP-SH3 Domäne konnte jedoch nicht bestätigt werden. GST-Pulldown Experimente mit Proteinextrakten aus HEK293 Zellen sowie adultem Mausgehirn wiesen auf eine Interaktion zwischen der MEGAP-SH3 Domäne und dem Formin mDia1 sowie dem Ena/VASP bindenden Protein Lamellipodin (Lpd) hin. In dieser Arbeit wurde die Assoziation zwischen MEGAP und Lpd nachgewiesen. Anhand von Co-IP Studien konnte die Interaktion zwischen MEGAP und Lpd sowohl in vitro als auch für die endogen exprimierten Proteine in vivo verifiziert werden. Hierbei stellt die Funktionalität der MEGAP-SH3 Domäne einen essentiellen Faktor für die Bindung von MEGAP an Lpd dar. Expressionsstudien zeigten weiterhin eine Co-Expression der Megap und Lpd mRNA während der murinen Embryonalentwicklung u.a. in Bereichen des Hinterhirns sowie in den trigeminalen Ganglien auf. In NIH-3T3 Mausfibroblasten co-lokalisierten MEGAP und Lpd verstärkt an Fokalen Adhäsionen sowie an der Zellmembran. Nur unter Co-Expression von MEGAP wurde Lpd an Fokalen Adhäsionen detektiert. Mit Hilfe von „Live Cell Imaging“-Analysen wurde gezeigt, dass MEGAP, unabhängig von seiner GAP-Aktivität, einen inhibierenden Effekt auf Lpd und damit verbundene Lamellipodien-Dynamik ausübt. Die Verwendung der MEGAP-SH3-Mutante Y755D demonstrierte, dass ein Verlust der Interaktion zwischen MEGAP und Lpd nicht nur die Co-Lokalisation der beiden Proteine an Fokale Adhäsionen unterbindet sondern auch die Ausbildung kleiner Lamellipodien trotz verbleibender GAP-Aktivität ermöglicht. Somit kann angenommen werden, dass MEGAP die Dynamik von Lamellipodien durch die Rekrutierung von Lpd an Fokale Adhäsionen hemmt.

Translation of abstract (English)

This work focused on the search for novel MEGAP interaction partners, a protein associated with severe mental retardation. MEGAP/srGAP3 is a member of the Slit-Robo GAP (srGAP) family and is involved in repulsive axon guidance and neuronal migration via Slit-Robo-mediated signal transduction. Affecting particularly the activity of Rac1 and binding to the WASP-related protein WAVE1, MEGAP has previously been shown to inhibit actin polymerisation. To understand the functional correlation of the interactions between MEGAP, the Slit-receptor Robo1 and further MEGAP interaction partners, at the beginning of this work mRNA expression patterns of Megap and Robo1 were investigated at different developmental stages of the murine embryonic development. These studies have shown the expression of Megap in many regions of the developing nervous system. The expression of the Megap transcript is initiated early during embryonic development (before E9.5 p.c.) and was detected especially in the stem cell rich areas of the brain, in the neural tube, in the neuronal tissue of the optic system as well as in various ganglia. In order to search for novel MEGAP interaction partners a Yeast-Two-Hybrid screen and GST-Pulldown experiments were carried out. During the Yeast-Two-Hybrid screen with a C-terminal MEGAP fragment and a human fetal brain cDNA library the nuclear protein Periphilin was isolated as a putative interaction partner. However, the binding of MEGAP to Periphilin via the MEGAP-SH3 domain could not be confirmed. GST-Pulldown experiments with protein extracts of HEK293 cells and adult mouse brain indicated an interaction between the MEGAP-SH3 domain and the formin mDia1 as well as the Ena/VASP binding protein Lamellipodin (Lpd). In this work, the associativity between MEGAP and Lpd was proven. By means of Co-IP studies the interaction between MEGAP and Lpd was verified both in vitro and for the endogenously expressed proteins in vivo. Here it was shown that the binding of MEGAP to Lpd depends on an intact MEGAP-SH3 domain. Furthermore, expression studies revealed the co-expression of Megap and Lpd mRNA for instance in some areas of the hindbrain and the trigeminal ganglia during the murine embryonic development. In NIH-3T3 mouse fibroblasts MEGAP and Lpd co-localized especially at focal adhesions as well as the cell membrane. Lpd was only detected at focal adhesion sites under co-expression of MEGAP. Live cell analyses revealed that MEGAP inhibits Lpd-evoked lamellipodial dynamics independently of its GAP activity. Furthermore it was demonstrated that loss of the interaction between MEGAP and Lpd, using the SH3-mutant Y755D, not only prevents the co-localization of both proteins at focal adhesions but also facilitates the formation of small lamellipodial protrusions despite the remaining GAP-activity. Together, these results show that MEGAP inhibits lamellipodial dynamics possibly by relocating Lpd to focal adhesion sites.