Deutsche Übersetzung des Titels: Unkonventionelle Sekretion : Protein Faltung und Qualitätskontrolle von FGF2 während der Membran Translokation

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Abstract

Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) ist ein proangiogener Wachstumsfaktor, der eine entscheidende Rolle bei der Tumor-induzierten Angiogenese spielt. FGF2 wird über einen bisher nicht bekannten Mechanismus von Säugetierzellen sezerniert, der auch nach Blockierung des ER/Golgi Systems durch Brefeldin A vollständig funktionell bleibt. Da FGF2 auch biomedizinisch ein sehr interessantes Targetprotein darstellt, ist die molekulare Aufklärung des Sekretionsweges von ausserordentlich grosser Bedeutung. In dieser Arbeit wurde ein experimentelles Modellsystem etabliert, dass mittels Durchflusszytometrie eine exakte Quantifizierung der FGF2 Expressionsrate unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erlaubt. Darüber hinaus wurden Testsysteme entwickelt, die den Exportvorgang sowohl mittels konfokaler Laserscanmikroskopie als auch durch biochemische Methoden wie die Zelloberflächenbiotinylierung rekonstituieren. Eine wesentliche Fragestellung bei der Aufklärung des molekularen Mechanismus der FGF2 Sekretion bestand in der Analyse des Faltungszustandes von FGF2 während des Exportvorganges. Auf der Basis der oben beschriebenen Modellsysteme wurde FGF2 als DHFR Fusionsprotein exprimiert, so dass der Faltungszustand durch einen exogenen Liganden kontrolliert werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass unter Bedingungen, die die Entfaltung des Moleküls nicht erlauben, die FGF2 Sekretionsrate nicht beeinflusst wird. Darüber hinaus konnten mit Hilfe eines sogenannten Piggyback Exportsystems Hinweise dafür gewonnen werden, dass eine Interaktion eines zweiten Reportermoleküls mit FGF2 während des Exportvorganges erhalten bleibt. Jedoch war die Effizienz dieses Piggyback Transportes gering, so dass diese Ergebnisse schwer interpretierbar blieben. Dennoch sind diese Beobachtungen konsistent mit den Ergebnissen, die mit Hilfe des DHFR Systems erhalten wurden. Weiterhin stimmen die in dieser Arbeit geschilderten Experimente in überein mit neueren Befunden aus unserem Labor, die auf eine Rolle von Heparansulfatproteoglykanen als Exportrezeptoren bei der Sekretion von FGF2 hinweisen. Diese Daten deuten ebenfalls auf einen Exportvorgang hin, während dessen FGF2 vollständig gefaltet bleibt. Die Summe der Daten hat wichtige Implikationen für den Mechanismus der FGF2 Sekretion, der nach heutigem Kenntnisstand durch eine direkte Translokation über die Plasmamembran erfolgt. Eine Verknüpfung des Exportvorgangs mit dem FGF2 Faltungszustand könnte somit Qualitätskontrolle gewährleisten, die die Sekretion von nicht funktionellen Molekülen ausschliesst.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

Fibroblast growth factor 2, a mediator of tumor-associated angiogenesis, is a mitogenic growth factor involved in various cellular processes. It is released by an unconventional secretory pathway independent of the ER/Golgi system. Due to its strong biomedical relevance it is of great interest to elucidate the molecular machinery involved in non-classical export. To analyze unconventional secretion, different model systems were established during this study including a FACS-based system which allows for a quantitative analysis of exported material bound to the cell surface and an analysis system employing confocal microscopy to analyze non-classical export qualitatively employing specific antibodies. Additionally, various biochemical analysis methods employing immobilized antibodies, as well as labelling of cell surface proteins using a membrane-impermeable biotinylation reagent to quantify exported FGF2 reporter molecules were established. In the second part of this thesis, these systems were used to analyze the folding state of FGF2 during unconventional secretion. The first experimental approach, termed DHFR fusion protein system, prevents unfolding during membrane translocation by aminopterin-dependent stabilization of a DHFR domain fused to FGF2. It could be shown that export of FGF2 is not affected under conditions where protein unfolding is prevented, although, based on the same system, mitochondrial import could be blocked. These findings suggest that export of FGF2 does not require unfolding. The second strategy, termed piggyback export analysis system, monitors the folding state of FGF2 and investigates potential means of quality control associated with unconventional secretion. The system is based on the export of non-covalent cytosolic complexes formed between two interacting domains, one fused to FGF2 and the other to non-exported GFP. To this end, a certain degree of piggyback export, could be detected, however, the efficiency was found to be low. In any case, the results are consistent with those obtained with the DHFR system in that it appears likely that FGF2 remains folded during membrane translocation. These findings are also supported by recent observations made in our laboratory pointing to a role of heparan sulfate proteoglycans as export receptors requiring FGF2 to be folded during export.