Englische Übersetzung des Titels: generation of Reg4 and HIP/PAP used for characterization of induced signaltransduction processes in Tumor cells of gastrointestinal origin

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Abstract

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle der „regeneration islet-derived gene family“ (Reg-Familie) im Zusammenhang der Krebsentstehung erläutert. Insbesondere wird dabei auf die Mitglieder Reg4 und HIP/PAP beim Menschen fokussiert. Daraus leiteten sich die Fragestellungen nach Reg4 und HIP/PAP abhängigen Signaltransduktionsmechanismen ab. Solche Prozesse sind für Reg4 und HIP/PAP bislang nur fragmentarisch verstanden. Eine strukturierte Signalkaskade induziert durch eine Transmembranrezeptorklasse ist nicht charakterisiert. Um hierzu neue Erkenntnisse zu liefern wurden Expressionsplasmide zur Generierung von Reg4 und HIP/PAP Protein generiert. Zu diesem Zweck wurden NS0-Zellen mit Reg4 und HIP/PAP Fc-Fusionsplasmiden transfiziert und durch Selektion Klone mit stabiler Expression hergestellt. Des Weiteren wurden Reg4- und HIP/PAP Expressionsplasmide ohne „Tag“ zur transienten Transfektion erzeugt. Durch Nutzen des transgen erzeugten amino- und carboxyterminalen „Fc-Tags“ wurden die Proteine gereinigt. Zum Nachweis von Reg4- und HIP/PAP-Protein wurden Antikörper produziert und charakterisiert. Für funktionelle Studien wurden Zelllinien auf endogene Expression von Reg4 und HIP/PAP hin analysiert und ausgewählt. Mit diesen Materialien wurden Stimulationsexperimente durchgeführt. Auf Ebene der Proteinphosphorylierungen wurden Reg4 und HIP/PAP abhängige Phosphorylierungen von zentral wirkenden Signaltransduktionsproteinen überprüft. Dabei konnte die Phosphorylierung von Erk1 und Erk2 in Abhängigkeit von Reg4 und HIP/PAP in Zellen mit endogener Reg4 Expression festgestellt werden. Diese Beobachtungen unterschieden sich von Zellen mit fehlender Reg4 Expression. So wurde in HT29-Zellen mit fehlender Reg4 Expression die Phosphorylierung von NFκB detektiert. Durch Mikroarray Studien wurde ein Expressionsprofil von HT29- Zellen nach Reg4 und HIP/PAP Stimulation erstellt, wobei Gene, die im Kontext von Apoptoseregulation und Migrationsprozessen als differentiell exprimiert ermittelt wurden. Durch Bindungsstudien sollten Hinweise auf eine mögliche Reg4 und/oder HIP/PAP Rezeptorfamilie erhalten werden, die es zu isolieren und zu charakterisieren gilt. Diese Experimente lieferten erste Indizien auf Zelllinien, die zu einer Rezeptorisolation herangezogen werden könnten.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

Summary The present thesis summarises the role of the „regeneration islet-derived gene family“ (Reg-family) for the development of cancer. The main focus is on the human Reg-family members Reg4 and HIP/PAP. Based on published data, the question did arise how Reg4 and/or HIP/PAP could be involved in signal transduction processes leading to a benefit of cancer cells in survival or apoptosis resistance. A well established signal transduction model including a transmembrane receptor class is missing so far. To get a better understanding for the biological role of these proteins, Reg4 and HIP/PAP expression systems with and without tag were generated. Aminoand carboxyterminal Fc-fusionvectors were established and stable NS0 cell clones expressing Reg4 and HIP/PAP Fc-fusionproteins were produced. These expression systems were used to purify Reg4 and HIP/PAP proteins. Cancer cell lines with endogenous Reg4 and/or HIP/PAP expression were screened and used for stimulation experiments. Further, Reg4 and HIP/PAP antibodies were produced and characterised. To get new information on the biological role of Reg4 and HIP/PAP selected cell lines were stimulated with Reg4 and HIP/PAP and induced protein phosphorylation of centre molecules of signal transduction processes were analysed. These experiments showed a Reg4 and HIP/PAP induced Erk1 and Erk2 phosphorylation in cells with endogenous Reg4 expression. In HT29-cells, which were lacking endogenous Reg4 expression, the treatment with Reg4 and HIP/PAP resulted in the observation of NFκB phosphorylation. Further, a gene expression profile was quantified by micro array studies on HT29-cells. These cells were stimulated with Reg4 and HIP/PAP. Differentially expressed genes by this assay could be put in groups of Apoptosis regulation and migration mechanisms. To isolate and characterise a receptor protein for Reg4 and/or HIP/PAP binding studies using 125Iodine probed Reg4 and HIP/PAP have been carried out. First results show indications for cell lines which could be useful for this approach.