German Title: Analyse der ERBB-Signaltransduktion und des Einflusses von spezifischen Wirkstoffen mittels Protein-Mikroarrays

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Abstract

This work was focused on the quantitative analysis of time-resolved in vitro measurements of ligand-induced ERBB signalling in breast cancer cell lines, as well as the development of experimental methods suitable for the large-scale analysis of signalling networks. First, an automated protocol for the highly reproducible stimulation of cell lines with growth factors was developed. In parallel, protein microarray technologies were advanced to the quantification of phosphoproteins and resulted in two different assay formats: microspot immunoassays and reverse phase protein arrays. In collaboration with the bioinformatics group, data analysis tools were developed for both platforms. Experiments in ERBB2 overexpressing cell lines, HCC1954 and SKBR3, demonstrated that both ERBB2 targeting monoclonal antibodies, trastuzumab and pertuzumab, did not efficiently prevent ligand-induced signalling in vitro. Moreover, the combination of both antibody therapeutics did not result in improved efficacy. However, combining a single therapeutic antibody with the EGFR inhibiting small molecule erlotinib significantly downregulated ligand-induced signalling. Furthermore, treatment of proliferating cells with the combination of trastuzumab and erlotinib resulted in a dephosphorylation of the ribosomal protein S6 and the cell cycle regulator protein RB resulting in cell cycle arrest. Thus, the combination of erlotinib with trastuzumab could be postulated as potential therapy for the treatment of ERBB2-positive breast cancer patients. A comparative analysis of ERBB signalling in four cell lines, MCF7, BT474, HCC1954, and SKBR3, revealed that the phosphorylation of the ribosomal protein S6 is a strong predictor to analyse the activation status of signalling networks since the S6 protein integrates signals from the MAPK as well as the PI3K pathway, the two major pathways downstream of ERBB receptors. Due to differential ERBB receptor expression or additional oncogenic mutations, therapeutics affected ERK1/2 and AKT signalling to different extents in the four cell lines whereas the S6 phosphorylation reflected reliably the cellular response on exogenous perturbations.

Translation of abstract (German)

Ziel dieser Arbeit war die Analyse der ERBB-Rezeptor anhängigen Signalwege in unterschiedlichen Brustkrebszelllinien und die Etablierung sensitiver Methoden für die quantitative Untersuchung von Signalnetzwerken. Zunächst wurde ein automatisiertes Protokoll für die reproduzierbare Zellstimulation mitWachstumsfaktoren entwickelt. Des Weiteren wurden Proteinarrays dahingehend angepasst, dass sie für die umfangreiche Analyse von phosphorylierten Proteinen eingesetzt werden konnten, wobei zwei Plattformen angewandt wurden: Microspot Immunoassays und Reverse Phase Protein Arrays. Für die Datenanalyse wurden in Zusammenarbeit mit der Bioinformatik-Gruppe der Abteilung verschiedene Algorithmen entwickelt. Experimente in den ERBB2 überexprimierenden Zelllinien HCC1954 und SKBR3 zeigten, dass die therapeutischen Antikörper gegen ERBB2, Trastuzumab und Pertuzumab, die ligandenabhängige Aktivierung der ERBB Signalkaskaden nicht wirkungsvoll verhindern konnten, und auch durch die Kombination beider Antikörper konnte keine stärkere Inhibition erzielt werden. Im Gegensatz dazu reduzierte die Kombination eines der Antikörper mit dem EGFR Inhibitor Erlotinib signifikant die Liganden induzierte Aktivierung der ERBB Signalkaskaden. Zusätzlich führte die Anwendung der Kombination von Trastuzumab mit Erlotinib auf proliferierenden Zellen zu einer Reduktion der Phosphorylierung des ribosomalen Proteins S6 und des Zellzyklusregulatorproteins RB und damit zu einem Zellzyklusarrest. Daher konnte die Kombination von Erlotinib mit Trastuzumab als potentielle Therapiemöglichkeit für Patientinnen mit ERBB2-positivem Brustkrebs postuliert werden. Der Vergleich der ERBB Signalkaskaden in den Zelllinien MCF7, SKBR3, HCC1954 und BT474 zeigte, dass S6 ein guter Indikator für den Aktivitätsstatus des Signalnetzwerks ist, da S6 durch Signale der ERBB Rezeptorabhängigen PI3K- und der MAPK-Signalkaskaden aktiviert wird. Während diese beiden Signalkaskaden bedingt durch verschiedene Expressionsmuster der Rezeptoren und durch onkogene Mutationen in den Zelllinien unterschiedlich auf die Therapeutika reagierten, spiegelte die Phosphorylierung des Proteins S6 den Einfluss exogener Signale am zuverlässigsten wider.