German Title: Unterdrückung der Aktivierung des angeborenen Immunsystems durch Modifikationen in bakterieller RNA

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Abstract

Modification of RNA is an important function in the immunological discrimination between self and non-self RNA. Naturally occurring RNA modifications have been identified that suppress activation of the innate immune response, e.g. 2’O-methylation of the ribose backbone. It has already been shown that incorporation of 2’O-methylation in siRNA abrogates TLR7-dependent interferon-alpha production in human plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In the present study, a native bacterial tRNA with 2’O-methylation at position G18 was analysed. It was found that the 2’O-methylation not only made the tRNA non-stimulatory, but also led to dominant inhibitory effects. Thus, this modification impaired immunostimulation by RNA species that would otherwise have been stimulatory. Further analysis revealed that not only was interferon alpha production by pDCs via TLR7 suppressed, but also secretion of pro-inflammatory cytokines by monocytes, including IL12p40 and TNF. Monocytes express a different subset of nucleic acid-sensing receptors, indicating that 2’O-methylated RNA influences the stimulation of different receptors. Analysis of other TLR ligands showed that the inhibitory effect was specific for stimulation by RNA but it was not observed for R848, a synthetic small molecule agonist of TLR7/8, or other TLR ligands. Investigation of the signalling pathway in response to RNA stimulation showed that modified, inhibitory RNA suppresses TLR stimulation at proximal levels. Preliminary binding studies indicated that 2’O-methylated RNA can bind directly to TLR7; it does not induce signalling but displaces unmethylated stimulatory RNA. As 2’O-methylation of tRNA at position G18 is found in tRNAs from many species and the neighbouring sequences are conserved, the influence of location and the whole sequence motif itself were investigated. The location of the 2’O-modification turned out to be of minor importance, but the inhibitory capacity of modified tRNA was influenced by the sequence of the motif. The sequence motif DmR was found to be necessary for immunosilencing of the tRNA, where D is a base other than cytosine with a 2’O-methyl position in the ribose of the nucleoside and R is a purine (adenine or guanine) immediately upstream of the methylation (position +1). Together, the results show that 2’O-methylation of RNA in a defined sequence motif abrogates immunostimulation in different cell types. Naturally occurring RNA modifications serve to distinguish self RNA from foreign RNA. The results from this thesis can be used to reduce immunostimulation by any RNA when immune stimulation is not intended.

Translation of abstract (German)

Natürlich vorkommende Modifikationen spielen eine wichtige Rolle bei der Unterscheidung zwischen eigener und fremder RNA. Verschiedene Modifikationen, die in der Lage sind, eine Immunantwort zu unterdrücken, wurden identifiziert. Eine von ihnen ist die 2’O-Methylierung der Ribose, welche, eingebaut in siRNAs, in der Lage ist die Interferon-alpha Produktion von plasmacytoiden Dendritischen Zellen (pDCs) durch TLR7-Aktivierung zu unterdrücken. In der vorliegenden Arbeit wurde eine bakterielle tRNA untersucht, die an der Position G18 eine natürlich vorkommende 2’O-Methylierung aufweist. Diese Modifikation führte nicht nur dazu, dass die tRNA alleine keine Interferon-alpha Produktion mehr aktiviert, sondern diese modifizierte tRNA und Bruchstücke daraus sind auch in der Lage, die Aktivierung durch stimulative RNA zu inhibieren. Es wurde weiter gezeigt, dass diese Inhibition nicht nur die Produktion von Interferon-alpha aus pDCs über TLR7 unterdrückt, sondern auch anderer pro-inflammatorischer Zytokine wie IL12p40 und TNF aus Monozyten, welche andere Nukleinsäure-erkennende Rezeptoren als pDCs exprimieren. Dies weist darauf hin, dass die Stimulation verschiedener Rezeptoren durch modifizierte RNA unterdrückt werden kann. Der Effekt ist allerdings spezifisch für die Stimulation durch RNA, da die Stimulation durch R848, einen sythtischen TLR7/8 Agonisten, oder durch andere TLR Liganden nicht inhibiert werden konnte. Untersuchungen auf der Ebene der Signalweiterleitung zeigten eine Inhibition durch modifizierte RNA bereits proximal in der Signalkaskade. Daher wurde die direkte Bindung von 2’O-methylierter RNA an TLR7 untersucht. Erste Studien zeigten, dass 2’O-methylierte RNA direkt an den Rezeptor bindet und nicht modifizierte, stimulative RNA verdrängt. Da 2’O-Methylierung an G18 in verschiedenen tRNAs beobachtet wurde, wurde der Einfluss von Position und Sequenzmotiv auf den inhibitorischen Effekt untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass weniger die Lokalisation der Modifikation innerhalb der tRNA sondern vielmehr die Sequenz um die Modifikation den Effekt beeinflusst. Das Sequenzmotive DmR wurde als das ausschlaggebende für die Inhibition identifiziert. Dabei ist D eine beliebige Base außer Cytosin mit der 2’O-Methylierung und R ist ein Purin an der Position +1 in 3‘ Richtung von der 2’O-methylierten Position. Zusammenfassend hat diese Studie gezeigt, dass RNA mit einer 2‘O-Methylierung in einem definierten Sequenzkontext, die Immunstimulation in verschiedenen Zellarten unterdrückt. Natürlich vorkommende 2’O-Methylierungen werden zur Selbst/Fremd Diskriminierung verwendet. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit können durch Einführung von 2’O-Methylierungen beliebige RNA Spezies inhibierend gemacht werden.