German Title: Charakterisierung von angeborenen zellulären Modulatoren der retroviralen Infektion

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Abstract

HIV-1 is a retrovirus that causes AIDS, a condition that is characterized by progressive failure of the immune system and emerging opportunistic infections. Research aiming at understanding mechanisms for retroviral spread and pathogenesis has recently started to focus on the innnate immune system and factors that have been demonstrated to either enhance or block infection in tissue-culture experiments. The work presented in this thesis aimed to characterize the expression and function of three cellular proteins; CD317, SAMHD1, and Siglec-1, that function as modulators of retroviral infection. In the first project, we investigated the in vivo expression pattern of the intrinsic immunity factor CD317 (BST-2, tetherin) in humans. CD317 restricts the release of enveloped viruses including HIV from infected cells. An additional proposed function for CD317 is as a selective target for immunotherapy of multiple myeloma, due to its apparently highly restricted expression on the surface of terminally differentiated B cells. To facilitate further studies of the biological functions, regulation, and therapeutic potential of CD317, we performed microarray-based expression profiling in 468 tissue samples from 25 healthy organs from more than 210 patients. CD317 protein could be detected in all organs investigated and in a number of specialized cell types, several of which are targeted in vivo by pathogenic viruses restricted by CD317 in tissue culture. We found limited co-expression of CD317 with the IFN biomarker MxA in vivo and low or no stimulation in organ explants exposed to recombinant IFNα, indicating that interferons may only partially regulate CD317. The study identified multiple thus far unknown interaction sites of viruses with CD317 and refutes the concept of its limited constitutive expression and strict IFN inducibility. Furthermore, CD317’s widespread expression questions its suitability as a target for immunotherapy. The second project involved characterizations of the restriction factor SAMHD1 in resting CD4+ T cells. SAMHD1 was reported to potently limit productive HIV-1 infection in a myeloid cell-specific manner by restricting HIV at the level of reverse transcription, and this block could be overcome by the Vpx protein of SIV and HIV-2. Our study demonstrated that SAMHD1 is also expressed abundantly in resting CD4+ T cells, where it locates to both the nucleus and cytoplasm. A staining protocol for SAMHD1 detection by flow cytometry was established, which enabled kinetic monitoring of its expression at a single cell level. Endogenous SAMHD1 levels were depleted in cells which either expressed Vpx following plasmid transfection or infection with Vpx-carrying HIV virions. In the latter case the restriction was alleviated, suggesting that reverse transcription is actively suppressed in resting CD4+ T cells, and that SAMHD1 is at least partly responsible for this restriction. The third project focused on the surface receptor Siglec-1 (sialoadhesin, CD169) that mediates trans-enhancement of HIV-1 infection through recognition of sialic acid moieties in virus membrane gangliosides. Our study demonstrated that mouse Siglec-1, expressed on macrophages, captures murine leukemia virus (MLV) particles and mediates their transfer to proliferating B- and T-lymphocytes. To investigate the interaction between Siglec-1 and virus and its importance for mediating trans-infection, we analyzed the potential of sialic acid precursor analogs to modulate the MLV/Siglec-1 interaction. MLV released from N-substituted D-mannosamine analog-pretreated cells displayed strikingly different capacities for Siglec-1-mediated capture and trans-infection. The N-acyl side chain of sialic acid was thus revealed as a critical functional determinant for the mouse Siglec-1-MLV interaction. In conclusion, the findings presented in this thesis provide new insights into the physiological expression pattern, regulation and function of the innate immunity factors CD317, SAMHD1 and Siglec-1. Characterizing the infection-modifying properties of these proteins might lead to a better understanding of their impact on retroviral spread and pathogenesis.

Translation of abstract (German)

HIV-1 ist ein Retrovirus, das AIDS auslöst, eine Krankheit, die durch progredientes Versagen des Immunsystems und damit einhergehenden opportunistischen Infektionen gekennzeichnet ist. Seit kurzem stehen Proteine der angeborenen Immunität, die einerseits die Infektion mit HIV-1 in Zellkulturexperimenten erleichtern oder andererseits hemmen, im Mittelpunkt derjenigen Forschung, die das Verständnis für die retrovirale Pathogenese und Ausbreitung im Körper zum Ziel hat. Die vorliegende Arbeit widmete sich der Charakteriserung von Expression und Funktion dreier zellulärer Proteine: CD317, SAMHD1 und Siglec-1, welche alle drei den Ablauf der retroviralen Infektion modulieren. Im ersten Projekt wurde das Muster der in-vivo-Expression des intrinsischen Immunitätsfaktors CD317 (BST-2, Tetherin) im Menschen untersucht. CD317 hemmt die Freisetzung behüllter Viren wie HIV von infizierten Zellen in Kultur. Zusätzlich wurde CD317 aufgrund seiner hochselektiven Expression auf terminal differenzierten B-Zellen als spezifischer Angriffspunkt für die Immuntherapie des Multiplen Myeloms diskutiert. Wir erstellten mithilfe eines Microarray-Gewebe-Systems ein Expressionsprofil in 468 Gewebeproben aus 25 gesunden Organen von mehr als 210 Patienten. Das CD317-Protein konnte in allen untersuchten Organen in mehreren spezialisierten Zelltypen detektiert werden; einige dieser sind Zielzellen von pathogenen Viren in vivo, welche von CD317 gehemmt werden. Wir fanden nur geringe Koexpression von CD317 mit dem Interferon-Biomarker MxA in vivo und nur geringe oder gar keine Stimulation in Organexplantaten, die wir mit rekombinantem IFNα behandelt hatten. Diese Befunde legen nahe, dass CD317 allenfalls teilweise von Interferonen reguliert wird. Die vorliegende Arbeit identifizierte mehrere bisher unbekannte Interaktionsorte von Virus mit CD317 und gibt Grund zum Anlass, das Konzept einer sehr limitierten konstitutiven Expression sowie der strikten IFN-Abhängigkeit in Zweifel zu ziehen. Darüber hinaus stellt die ubiquitäre Expression in Frage, dass CD317 ein geeigneter Angriffspunkt für immuntherapeutische Ansätze sein könnte. Das zweite Projekt untersuchte das antivirale Potential des Restriktionsfaktors SAMHD1in ruhenden CD4+-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. SAMHD1 wurde beschrieben, die Infektion von HIV-1 auf der Ebene der reversen Transkription in Zellen myeloischer Herkunft effizient zu begrenzen; dieser Block kann durch die Expression des Vpx-Proteins von SIV oder HIV-2 überwunden werden. Die vorliegende Arbeit führte aus, dass – konträr zum angenommenen Expressionsmuster – SAMHD1 ebenfalls in hohem Maße in ruhenden T-Zellen exprimiert wird, in denen es sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma vorkommt. Ein Protokoll zur Anfärbung und Detektion von SAMHD1 mithilfe von Durchflusszytometrie wurde etabliert. Dieses gestattete die Untersuchung der antiviralen Aktivität auf Einzelzellebene. Endogenes SAMHD1 konnte durch Transfektion von Vpx oder Infektion mit HIV-1 oder HIV-2, die Vpx inkorporiert hatten, abgebaut werden. Letzteres führte zu einer Reversion der Restriktion in ruhenden T-Zellen und zeigte, dass SAMHD1 zumindest teilweise für diese Restriktion verantwortlich ist. Das dritte Projekt konzentrierte sich auf den Zelloberflächenrezeptor Siglec-1 (Sialoadhesin, CD169), welcher die trans-Infektion von HIV-1 durch die Erkennung von Sialinsäurebestandteilen in Gangliosiden der viralen Membran vermittelt. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass Maus-Siglec-1, das auf Makrophagen exprimiert wird, Partikel des murinen Leukämievirus (MLV) einfangen und die Übertragung auf proliferierende B- und T-Lymphozyten ermöglichen kann. Um die Wechselwirkungen zwischen Siglec-1 und Virus sowie deren Bedeutung für die Vermittlung der trans-Infektion zu untersuchen, analysierten wir den Effekt hierauf von Analoga der Vorläufersubstanzen der Sialinsäure. MLV, das aus Zellen freigesetzt wurde, die mit N-substituierter D-Mannosaminanaloga behandelt worden waren, zeigten deutlich veränderte Fähigkeiten für die Siglec-1-vermittelte trans-Infektion. Die N-Alkylseitenkette von Sialinsäure wurde als krtische funktionelle Determinante für die murine Siglec-1-MLV-Interaktionen identifiziert. Zusammenfassend tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse über das physiologische Expressionsmuster, die Regulation sowie die Funktion von CD317, SAMHD1 und Siglec-1 zu einem breiteren wie tieferen Verständnis bei. Diese Faktoren der angeborenen Immunität sind Modulatoren der Infektion. Die Charakterisierung der infektionsmodulierenden Eigenschaften können einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Ausbreitung und Pathogenese retroviraler Infektionen leisten.