English Title: Analysis of neuron-generating cell divisions in the mouse neuropithelium

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Abstract

In Vertebraten wird Dauer der Proliferationsphase neuronaler Vorläuferzellen im Neuroepithel (Neuroepithelzellen) und damit die Neuronenzahl des Gehirns vermutlich durch den Übergang von im cell fate symmetrischen, proliferativen (Generierung zweier Neuroepithelzellen) zu asymmetrischen differenzierenden Zellteilungen (Generierung einer Neuroepithelzelle und eines Neurons) kontrolliert. Direkte Beweise für die Existenz dieser asymmetrischen Teilungen stehen noch aus, genauso wie zellbiologische Mechanismen und genetische Kontrolle des „Umschaltens“ unbekannt sind. Durch die Expression von GFP unter Kontrolle regulatorischer Sequenzen des TIS21-Gens wurden spezifisch Neurone-generierende Neuroepithelzellen markiert, um (i) die Symmetrie der Neurone-generierenden Zellteilung videomikroskopisch zu untersuchen und (ii) eine differenzielle Analyse der Zellbiologie (z.B. Verteilung apikaler Membran, Zellzyklusdauer) und Genexpression von proliferierenden vs. Neurone-generierenden Neuroepithelzellen zu ermöglichen. Es wurden drei transgene und eine TIS21-GFP-knock in-Mauslinie etabliert. Im TIS21-GFP-knock in ersetzt eine GFP-Expressionskassette das offene Leseraster von TIS21 in Exon 1. Der TIS21-GFP-knock in exprimiert entlang des ganzen Neuralrohrs GFP in Neurone-generierenden Neuroepithelzellen, die transgenen Linien jeweils nur in bestimmten Abschnitten. Die Expression von TIS21 im Neuroepithel wird offensichtlich von verschiedenen Elementen gesteuert, die jeweils bestimmte Regionen im Neuralrohr abdecken. In Schnittkulturen von Neuralrohr-Explantaten aus TIS21-GFP-knock in-Embryonen wurden mit Multiphoton-Videomikroskopie zu Beginn der Neurogenese (E12 Telencephalon) neben sich apikal teilenden Zellen auch überraschend Zellen entdeckt, die sich auf der basalen Seite des Neuroepithels teilen. Apikalen Teilungen bilden wahrscheinlich ein Neuron und eine Neuroepithelzelle, basale bilden zwei Neurone. Demnach existieren in Vertebraten zwei Typen Neurone-generierender Teilungen: (i) im cell fate asymmetrische, apikale Teilungen typischer Neuroepithelzellen und (ii) symmetrische, basale Teilungen einer hier erstmals beschriebenen Zellpopulation. Die Verteilung apikaler Membran und die Zellzykluslänge wurden in proliferierenden vs. Neurone-generierenden Neuroepithelzellen als mögliche Steuerungsmechanismen des Übergangs von Proliferation zu Neurogenese untersucht. Die Orientierung der Teilungsebene (abgeleitet aus der Chromatinfärbung in der Anaphase) relativ zur apikalen Membran identifiziert als Lücke in der basolateralen, Cadherin-positiven Plasmamembran in frühen Stadien der Neurogenese (E10..5-E11.5) im TIS21-GFP-knock in zeigt, dass der Schritt von Proliferation zu Neurogenese durch einen Wechsel in der Verteilung apikaler Membrankomponenten kontrolliert werden könnte: Apikale Teilungen mit symmetrischer Verteilung der apikalen Membran sind größtenteils proliferierend, Teilungen mit asymmetrischer Verteilung der apikalen Membran Neurone-generierend. Zudem korreliert die Differenzierung mit einer Verlängerung des Zellzyklus: Durch eine kumulative BrdU-Markierung konnte gezeigt werden, dass sich zu Beginn der Neurogenese (E10.5 Telencephalon) der Zellzyklus der Neurone-generierenden Neuroepithelzellen um 40% auf 13 h, gegenüber 9 h in proliferierenden Neuroepithelzellen, verlangsamt. Eine ursächliche Beteiligung von TIS21, das spezifisch in Neurone-generierenden also sich langsamen teilenden Neuroepithelzellen exprimiert ist und bekanntermaßen Zellzyklus-verlangsamend wirkt, an diesem Phänomen ist noch nicht geklärt. Homozygote TIS21-GFP-knock in-Tiere, als TIS21-knock out-Modell, zeigen zumindest keinen offensichtlichen qualitativ veränderten Ablauf der Neurogenese. Dagegen verschiebt sich im Blutbild das Gleichgewicht von Lymphozyten zu Granulocyten. In Verbindung mit dem in dieser Arbeit beschriebenen embryonalen und adulten Aktivitätsmuster - TIS21 ist in differenzierenden Zellpopulationen verschiedener Gewebe exprimiert - impliziert dies eine allgemeine physiologische Funktion von TIS21 bei Proliferations- und Differenzierungsprozessen. In einer unabhängigen Serie von Experimenten wurde die Möglichkeit untersucht, durch RNA-interference (RNAi) spezifisch die Expression von Genen in postimplantorischen Mausembryonen zu unterdrücken. Konkret wurde esi-(endoribonuclease III-prepared short interfering)-RNA (esiRNA) in E10 Mäuseembryonen intraventrikulär injiziert, durch Elektroporation in Neuroepithelzellen transfiziert und der Effekt von RNAi nach 24 h in vitro-Kultur der Embryonen analysiert. esiRNA gegen b-Galaktosidase, koelektroporiert mit einem b-Galaktosidase- und einem GFP-Expressionsvektor, inhibierte spezifisch die b-Galaktosidase- nicht aber die GFP-Expression. In einem analogen Experiment in E10 TIS21-GFP-knock in Embryonen verhinderte die Elektroporation von esiRNA gerichtet gegen GFP die GFP-Expression zu Beginn der Neurogenese – d.h. die Expression eines endogen exprimierten Gens.

Translation of abstract (English)

In the vertebrate central nervous system, the number of neurons depends on the timing of the switch from proliferative to neuron-generating cell divisions of neuronal precursor cells (neuroepithelial cells). In this context, two interrelated aspects of neurogenesis are poorly understood: (i) the symmetry of the neuron-generating cell divisions and (ii) the mechanisms and genes that control the switch from proliferative to neuron-generating cell divisions. Expressing GFP under the control of the TIS21 gene, we specifically labelled neuron-generating neuroepithelial cells (i) to analyse the symmetry of neuron-generating cell divisions by video microscopy and (ii) to identify potential control mechanisms and genes by comparing cell biology and gene expression profile of neuron-generating vs. proliferating neuroepithelial cells. To this end, we established three transgenic and one TIS21-GFP knock in mouse line. In the latter, the ORF of TIS21 Exon 1 is replaced by a GFP expression cassette, creating a null allele for TIS21. Hence homozygous mice can serve as TIS21 knock out model. The transgenic lines express GFP in subset of, the knock in line in all, neuron-generating neuroepithelial cells. The distinct expression patterns suggest different region specific, evolutionary conserved regulatory elements in the TIS21 gene. The results show that an in vivo functional TIS21 promoter specific for neuron-generating but not proliferating neuroepithelial cells could be identified and that the heterozygous TIS21-GFP knock in line represents a useful model system to visualize neurogenesis. Multiphoton video microscopy of short term (<16h) slice explant cultures derived from heterozygous TIS21-GFP knock in mice, revealed two independent types of neuron-generating cell divisions: (i) asymmetric divisions of typical neuroepithelial cells at the luminal surface of the ventricular zone, generating one neuron and one neuroepithelial cell and (ii) symmetric divisions of a newly identified neuronal precursor cell at the basal side of the ventricular zone, generating two neurons. Morevoer, data suggest that the latter type contributes to the majority of cortical neurons. The role of apical membrane and cell cycle length in the control of the switch from proliferation to neuron-generating cell division was investigated. The distribution of the apical membrane during mitosis was deduced from the orientation of the cleavage plane, determined by the position of the chromosomes in anaphase, relative to the apical membrane, identified immunohistochemically as prominin-positive, cadherin-negative domain of the plasma membrane. 78% of TIS21-GFP-negative, proliferative divisions distributed the apical membrane symmetrically. 90% of the TIS21-GFP-positive, neuron-generating divisions distributed the apical membrane asymmetrically to only one of the daughter cells. Therefore a correlation between an asymmetric distribution of apical membrane during apical mitosis correlates with neuron-generating cell divisions and could force the daughter cells to adopt the observed asymmetric fate. Cumulative BrdU-labelling (2-16 h puls length) revealed an increase in cell cycle length from 9 to 13 h in the TIS21-GFP-positve and -negative cells respectively. This data strongly suggests that the selective 40% increase in cell cycle length prior neuron-generating division could be cause of the switch from proliferation to neurogenesis. TIS21 itself seems to be involved in the observed slowing of the cell cycle, as it has been shown to have an antiproliferative function in vitro. Interestingly, homozygous TIS21-GFP knock in mice show a shift from lymphocytes to granulocytes in their bone marrow. Together with the expression of TIS21 in the neuroepithelium and, as shown here, in other embryonic and adult stem cell containing tissues, this strongly suggests a general physiological role for TIS21 in the control of proliferation and differentiation processes. In a different set of experiments, the use of RNAi (RNA-interference) to knock down endogenous gene expression in postimplantation mouse embryos was investigated. Specifically, esi-(endoribonuclease III-prepared short interfering)-RNA was injected intraventricularly into E10 embryos, introduced into neuroepithelial cells by electroporation and the effect of RNAi was analysed after 24 h in vitro culture. EsiRNA directed against b-galactosidase, coelectroporated with b-alactosidase and GFP-expressions vectors, specifically suppressed b-galactosidase but not GFP-expression. In a similar experiment, esiRNA directed against GFP inhibited GFP expression in TIS21-GFP knock in embryos at the onset of neurogenesis. Both results show that esiRNA induces RNAi and selectively suppresses gene expression in postimplantation embryos.