English Title: Schlussleisten (Zonulae occludentes) and Biochemically Related Structures: Tight Junction-Proteins and -Functions in Stratified Epithelia, With Special Reference to Squamous Epithelial Metaplasia

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Abstract

In vielzelligen Organismen bilden Epithelien an der Körperoberfläche und als Auskleidung der inneren Lumina funktionelle Grenzschichten, die sowohl das Körperinnere von der äußeren Umwelt und die Fortsetzung der Körperoberfläche, d.h. die Lumina der Organe trennen als auch das Körperinnere in verschiedene Kompartimente unterteilen. Dabei sind die Epithelzellen jeweils in charakteristischer Weise durch verschiedene Zell-Zell-Verbindungen zu einem bestimmten Epithelgewebe gekoppelt. Die „Tight Junctions“ (TJ) sind dabei für die Herstellung und Aufrechterhaltung der unterschiedlichen molekularen Zusammensetzungen der einzelnen Kompartimente, vor allem als Haupt-Barriere für die parazelluläre Ausbreitung von Zellen, Partikeln und vielen Molekülarten, besonders wichtig. Während die Zell-Zell-Verbindungen der TJ seit den 1960er Jahren in einschichtigen polaren Epithelien sowohl strukturell als auch funktionell eingehend untersucht worden sind, galt bis zur Jahrtausendwende noch die überwiegende Ansicht in der Fachliteratur – auch als Lehrbuchdogma -, dass TJ oder äquivalente Strukturen in mehrschichtigen Epithelien nicht vorkommen und hier andere Strukturen, nämlich interzelluläre Lipid-Akkumulationen, für die Bildung und Aufrechterhaltung der Barriere-Funktion verantwortlich sind. Nachdem in den letzten Jahren jedoch TJ-Proteine sowie TJ-artige Strukturen und Funktionen in einigen mehrschichtigen Epithelien und davon abgeleiteten Geweben (Hassall-korpuskel und Tumoren) nachgewiesen worden sind, sollte in der vorliegenden Dissertation geklärt werden, welche TJ-Proteine in bestimmten TJ-Strukturen oder in sog. „TJ-verwandten“ Anordnungen in mehrschichtigen Epithelien von Säugetieren vorkommen. Außerdem sollte geklärt werden, ob und wie pathologische mehrschichtige Epithel-Bildungen wie sog. Plattenepithel-Metaplasien oder bestimmte Strukturen in Plattenepithel-karzinomen typische TJ-Proteine enthalten können. Bei diesen Untersuchungen konnten zunächst kleine, punkt- oder zapfenförmig erscheinende TJ-artige Membran-Kontaktstellen als häufige interdesmosomale Strukturen nachgewiesen werden: Mit Hilfe der Gefrierbruchtechnik ließen sich elektronenmikroskopisch in der Membranspaltebene zwischen den Desmosomen diese kleinen Strukturelemente als säulenstumpfartige Erhebungen von bis zu ca. 12 nm Durchmesser darstellen, die an manchen Stellen auch zu linearen, z.T. gewundenen und verzweigten Reliefbändern fusioniert erschienen. Zumindest in bestimmten Plattenepithelien entsprachen die Positionen dieser interdesmosomalen Membran-Kontakte in licht- wie in elektronenmikroskopischen Immunlokalisierungsexperimenten Stellen, an denen typische TJ-Proteine wie z.B. Occludin oder bestimmte Claudine angereichert waren. Diese neuartigen TJ-Protein-Strukturen wurden daher als „Stud Junctions“ (Puncta occludentia) bezeichnet und mit anderen TJ-verwandten, Claudin- bzw. Occludin-haltigen interdesmosomalen Strukturen wie den „Lamellated Junctions“ oder den „Sandwich Junctions“ einiger Plattenepithelien verglichen. Zur möglichen molekularen Struktur und zur Bedeutung dieser „Stud Junctions“ werden Hypothesen vorgestellt. Weiterhin konnten TJ-Proteine und sowohl typische TJ- als auch TJ-verwandte Strukturen in metaplastisch verändertem Bronchialepithel in situ und in vermeintlich mehrschichtigen Zellkultur-Modellen der Plattenepithelmetaplasie nachgewiesen werden, wobei z.T. auch die jeweilige Fähigkeit, eine Barriere-Funktion in der Kulturschale auszuüben, untersucht wurde. Durch biochemische und immunologische Analysen ließen sich dabei TJ-Proteine wie Claudin-1, Claudin-4 und Claudin-7 nachweisen, vielfach zusammen mit Occludin bzw. Protein ZO-1. Elektrophysiologische Messungen ergaben aber, dass in sog. „Monolayer“-Kulturen von aus Bronchialepithelien abgeleiteten Zellen diese TJ-artigen Gebilde für die Barriere-Funktion allenfalls nur eine sehr geringe Bedeutung haben können. Denn im Vergleich mit der von einem Kolonkarzinom abgeleiteten, polaren Epithelzell-Linie CaCo-2 wiesen die polaren bronchialepithelialen Zellen der Linien 16HBE und CaLu-3 recht niedrige - und die an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzschicht induzierten Metaplasie-Modelle („Multilayer“-Kulturen) sogar nur äußerst geringe - Widerstandswerte auf, deren Signifikanz überdies noch zweifelhaft blieb. Biochemische Befunde, vor allem bei Immunpräzipitationsexperimenten, legten außerdem den Schluss nahe, dass bei diesen bronchialepithelialen Zellkulturen 1 Zusammenfassung Claudin-1 mit Claudin-7 und dem ebenfalls vorkommenden Claudin-4 Komplexe bilden kann. Dagegen wurden bei CaCo-2 Zellen ausschließlich Interaktionen von Claudin-1 mit Claudin-7 nachgewiesen. Zusätzlich konnten TJ-Proteine (z.B. Occludin, Claudin-1, Claudin-4, Claudin-7, Protein ZO-1, Cingulin) und zum Teil auch TJ-artige Strukturen in bestimmten Bereichen unterschiedlich differenzierter Plattenepithelkarzinome - auch der Lunge - und in Plattenepithelmetaplasien in situ sowie in den entsprechenden Zellkulturmodellen erkannt werden. Auch das erst jüngst entdeckte TJ-Transmembranprotein Tricellulin konnte an den jeweiligen Kontaktstellen von drei Zellen nicht nur in einschichtigen Epithelien und davon abgeleiteten Zellkulturlinien lokalisiert werden, sondern auch an den entsprechenden Stellen in der obersten Schicht von Kulturen mehrschichtiger Keratinocyten der menschlichen HaCaT-Linie. Ein Nachweis von Tricellulin-haltigen Kontakten in mehrschichtigen Epithelien in situ scheiterte allerdings bisher daran, dass im Menschen – mindstens - zwei Spleißformen des Tricellulin-Gens vorkommen, aber für die hier wohl relevante zweite Spleißvariante bisher noch kein spezifischer Antikörper zur Verfügung stand. Die Barriere- bzw. Selektions-Funktion der TJ-Strukturen in mehrschichtigen Epithelien und entsprechenden Zellkultur-Modellen konnte auch mit Hilfe wasserlöslicher Nachweismittel (Tracer) wie z.B. LaCl3 oder mit Dextran-Partikeln verschiedener Größe elektronen-mikroskopisch bzw. in physiologischen Translokationsexperimenten bestätigt werden. Die Befunde werden auch im Zusammenhang mit der Hypothese einer extrazellulären „Lipid-Barriere“ diskutiert bzw. als Bestätigung der Vorstellung, dass es in vielen, vielleicht allen Plattenepithelien zwei verschiedene Barriere-Systeme für parazelluläre Molekülverteilungen gibt, die beide essentiell, aber auch komplementär sind, d.h. dass es sowohl ein TJ-System als auch eine Absperrung durch interzelluläre lipidreiche Dichtungen gibt. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen also, dass es in mehrschichtigen Epithelien generell TJ-Proteine in verschiedenen TJ-artigen Struktursystemen, aber auch in weiteren, bisher noch nicht hinreichend erforschten „Junction“-Strukturen gibt, wobei in jedem Fall mindestens ein komplettes „Abschluss-System“ in den obersten lebenden Zellschichten vorkommt und wohl essentiell ist. Von den zusätzlichen TJ-Protein-haltigen Strukturen ist das in dieser Arbeit definierte interdesmosomale Punctum occludens das räumlich kleinste, durch seine Häufigkeit aber sicherlich auch bemerkenswerteste Strukturelement, das es nun in zukünftigen Experimenten in seiner Funktion und möglichen Beteiligung beim Aufbau größerer TJ-Strukturen aufzuklären gilt. Während die Bronchial-Plattenepithel-Metaplasie in situ einem ähnlichen geordneten Aufbau wie andere Plattenepithelien aufweist, stellen die mehrschichtig erscheinenden Zellkultur-Systeme bronchialepithelialer Herkunft kein Kultur-Modell einer Metaplasie, sondern eine Zellkultur-Struktur sui generis dar, bei der TJ-artige Molekülanordnungen in praktisch allen Zellschichten vorkommen. Die Bedeutung dieser Befunde für einige Funktionen solcher Epithelien, bestimmter krankhafter Entartungen (Plattenepithelmetaplasien) und in der zukunftigen Tumordiagnostik wird diskutiert.

Translation of abstract (English)

In the multicellular organisms of the animal kingdom, the epithelia provide a structural continuum covering the body surface and certain luminal spaces of inner organs, thus separating the environment and the lumina from the body interior and establishing several internal compartments and organs. Characteristically, the specific epithelial cells are interconnencted by diverse kinds of cell-cell junctions to form and maintain a certain epithelial tissue. In this epithelial system, the “tight junctions” (TJ) are of crucial importance for the assembly and stable interaction of the molecular components of the individual compartments, in particular as they represent the main barrier to the paracellular translocation of cells, particles and molecules. While TJ have been extensively studied since the 1960s with structural and physiological methods in simple, polar epithelia, it has been a long-standing, general dogma in the literature, textbooks included, that TJ structures do not occur in stratified epithelia and that in certain squamous stratified epithelia such as the epidermis, for example, a totally different kind of structure, i.e. intercellular lipid accumulations, are responsible for the formation and maintenance of the barrier and its functions. As, however, in recent years TJ-proteins and compositionally TJ-related structures have been identified in some squamous stratified epithelia and epithelial tumors, it should be clarified in this thesis which of these proteins occur in specific TJ-structures or in other assemblies of mammalian stratified epithelia or of cultured cells derived therefrom. Specifically, it should also be elucidated whether and in which way pathological formations of stratified epithelial cells such as squamous epithelial metaplasias or certain special structures within squamous cell carcinomas can form TJ-related or are based on structures. In the course of these experiments, it has been noted that additional small, interdesmosomal, TJ-related cell-cell-contact structures occur in several of these tissues. Using freeze-fracture electron microscopy, small (diameter ≤12 nm) columnar projections have been noticed in the intramembranous fracture plane, which sometimes appear to line up and form limited curvilinear rows and ridges, corresponding in certain cell layers of stratified epithelia to interdesmosomal membrane-membrane contact sites of enrichment of occludin and/or some members of the claudin families of proteins. These novel small structural elements, termed “stud junctions” (Puncta occludentia), have therefore been compared with – and differentiated from – other interdemosomal, TJ-protein-rich structures recently defined in stratified epithelia such as the “lamellated junctions” and the “sandwich junctions”. Hypotheses of the possible molecular structure and of functional roles of stud junction assemblies are presented. 3 Zusammenfassung TJ-proteins as well as typical TJ and TJ-related structures have been detected in airway epithelia, including tracheal and bronchial epithelium as well as squamous cell metaplasias, and also putative cell culture metaplasia models, and such cell layers have also been examined in physiological experiments for their transepithelial resistance and possible barrier functions with respect to paracellular diffusion and translocation processes. Using biochemical and immunological methods, several transmembrane TJ-proteins (e.g. occludin, claudins -1, -4 and -7) as well as TJ-plaque-proteins such as protein ZO-1 and cingulin have been detected in such junctions. Electrophysiological measurements, on the other hand, have made it clear that possible barrier functions can only be at a very low level, if at all significant, in layers of cultured bronchial cells, in particular in comparison with certain other polar epithelial cell monolayers such as those formed by the intestinal cell line CaCo-2. Such minimal transepithelial resistance and barrier effects have been observed in electrophysiological measurements as well as in experiments in which paracellular diffusions of dextran beads of certain size classes and of lanthanum ions have been examined. Correspondingly, only very little restriction of paracellular translocations have been noted when air-liquid-interface-grown, - stratified looking bronchioepithelial cell layer cultures of the lines 16HBE and CaLu-3 have been examined. Moreover, using detergent-lysed cells, biochemical analyses of co-immunprecipitation experiments, have revealed that in these bronchioepithelial cell culture lines, protein complexes of claudin-1 with claudin-4 or claudin-7 were present. In general, a number of TJ-proteins (e.g. claudins -1, -4, -7, occludin, protein ZO-1, cingulin) as well as some of the TJ-related structures have also been detected - in various combinations – in some of the squamous epithelial metaplasias and certain differentiated subforms of squamous cell carcinomas of the lung. Moreover, using immunocytochemistry, the very recently discovered TJ-protein, tricellulin, has not only been localized in polar epithelial cells of airways in situ and in culture precisely and only to sites at which three cells form angular contacts but also in the uppermost layer of cells of cell culture systems forming squamous multilayer epithelia such as keratinocytes of the line HaCaT. The fact that tricellulin has not been detected in some stratified tissues in situ and in certain cell culture monolayers may be explained by the finding of the existence of more than one mRNA-splice-form of tricellulin and the lack of immunological cross-reactivity between these isoforms with two specific antibodies used. The results show that in squamous epithelia TJ-proteins generally occur in different TJ-related structures but also in other, yet largely unknown cell-cell-interaction structures, and that in these stratified epithelial structures an assembly of TJ-proteins and some apical barrier system has been found. Of all these various TJ-protein-containing structures the punctum occludens is certainly the smallest subunit known. While the bronchial squamous epithelial metaplasia in situ shows a vertically differentiated layer organisation, the apparently multilayered cell culture systems derived from bronchial cells and grown at an air-liquid-interface do not display significant differentiation of this kind and an apical barrier system but represent an artificial cell growth system sui generis. The observations are discussed with respect to diverse functions of such epithelia, including pathological derivatives, and also with respect to the potential value of such findings and reagents in diagnostic pathology.