German Title: Rolle von Ame1, einer zentralen Komponente des Saccharomyces cerevisiae Kinetochores, für die Kinetochorfunktion und -struktur

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Abstract

SUMMARY The present work provides an analysis of kinetochore function and structure with respect to Ame1, a central component of the yeast Saccharomyces cerevisiae kinetochore. Applying mutant analyses (ame1-2) and biochemical binding assays the following results were obtained: 1. Classical kinetochore functions, chromosome attachment, chromosome segregation, and the supervision of these events by the spindle assembly checkpoint were analyzed in the ame1-2 mutant: • The Ame1 protein is needed for the establishment of bipolar attachments to microtubules emanating from opposing poles. Under tension one of the attachments is lost due to a structural weakening of the kinetochore, which results in monopolar segregation of sister chromatides. • Checkpoint analysis revealed that checkpoint functions are not impaired in the mutant, as judged by the inducement of the occupancy checkpoint and the ability of ame1-2 cells to sense their own attachment / tension defect. 2. ame1-2, as also other kinetochore mutants, causes a severe defect in the stability of interpolar microtubules (mitotic spindle). This effect is somewhat surprising, since kinetochores and interpolar microtubules do not interact with each other. Failure in spindle formation caused by kinetochore defects can be explained in two alternative ways: First, kinetochore proteins can also function as spindle stabilizing MAPs (microtubule associated proteins). Second, spindle defects are also observed if a separation of spindle poles occurs in absence of Esp1 and Cdc14 activity. Following experimental evidence suggests that the spindle defect in ame1-2 is not due to the above mentioned causes, but rather results from an alternative function of the kinetochore that is compromised in the mutant in a cell cycle dependent manner: • Ame1 does not locate to the mitotic spindle and thus is not a MAP. • As mentioned above, the ame1-2 mutant fails to achieve a stable bipolar attachment leading to the separation of spindle poles. In parallel the mutant senses this defect and maintains an active spindle assembly checkpoint which inhibits Esp1 and Cdc14 activation. As described (Higuchi and Uhlmann, 2005), such a spindle defect can be rescued by overexpression of Esp1 or Cdc14. The main cause for the spindle defect in ame1-2 however, is not a spindle pole separation in presence of low Esp1 or Cdc14 activity: i) Overexpression of Cdc14 in ame1-2 does not rescue the spindle defect of the mutant. ii) Overexpression of Esp1 in ame1-2 does only allow for a partial rescue of the spindle defect. iii) Inactivation of the spindle assembly checkpoint by Mad2 depletion also leads to only a partial rescue of the spindle defect. iv) A considerable number of cells separate their spindle pole bodies in presence of active Esp1, but nevertheless display a spindle defect. v) Most spindle defects occur at spindle pole distances that are characteristic of metaphase, when spindle stability is independent of the presence and activity of Esp1. • The ame1-2 kinetochore defect is more severe (particularly the kinetochore localization of the Mtw1 complex) when the mutation is induced prior to an establishment of bipolar attachment than after. This differentially compromised kinetochore structure in ame1-2 is apparently reflective of derived kinetochore functions. Similar kinetochore defects (monopolar segregation, failure in Cdc14 release) are observed, no matter if the mutation is induced before or after bipolar attachment. However, only the latter situation allows for the assembly of wild type metaphase and anaphase spindles. Thus, a certain kinetochore structure (including the Mtw1 complex) may be involved in generating a spindle stabilizing factor. 3. The present structural model of the S. cerevisiae kinetochore has been refined in the current work by the following findings: • A direct protein interaction network between the Okp1 / Mtw1 / Spc105 / Ndc80 kinetochore complexes could be established by in vitro binding assays performed with isolated protein complexes. • These data together with those derived from ChIP analyses of the ame1-2 mutant show a clear dependency of the centromeric association of all other central and outer kinetochore complexes on the Okp1 complex and are thus placing this complex in close proximity to the DNA binding CBF3 complex. • However, when bipolar attachments are achieved prior to the induction of ame1-2, the localization of the Mtw1 complex becomes independent of the presence of the Okp1 complex. The functional characterization of Ame1 in combination with the biochemical mapping of intra-kinetochore interactions allowed for a structural refinement of the present-state kinetochore model. Moreover, a direct influence of the kinetochore on spindle stability has been uncovered, which may be attributed to the presence of the Mtw1 complex.

Translation of abstract (German)

ZUSAMMENFASSUNG Die vorliegende Arbeit liefert eine Funktions- und Strukturanalyse des Kinetochors unter Berücksichtigung von Ame1, einer zentralen Kinetochorkomponente in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Mit Hilfe von Mutantenanalysen (ame1-2) und biochemischen Bindungsexperimenten wurden folgenden Ergebnisse erzielt: 1.Klassische Kinetochorfunktionen, Chromosomenanheftung, Chromosomenverteilung und die Überwachung dieser Ereignisse durch den Spindel-Checkpoint, wurden in der ame1-2 Mutanten analysiert: • Das Ame1 Protein wird für eine bipolaren Anheftungen an Microtubuli benötigt. Unter Spannung geht eine dieser Anheftungen aufgrund einer strukturellen Schwächung des Kinetochores verloren, was zu einer monopolaren Verteilung von Schwesterchromatiden führt. •Checkpoint Analysen zeigten, dass die Funktionalität des Spindel-Checkpoints in der Mutanten nicht beeinträchtigt ist. 2. ame1-2, wie auch andere Kinetochormutanten, verursacht einen schweren Defekt in der Stabilität der interpolaren Microtubuli (mitotische Spindel). Fehler in der Spindelausbildung, die auf Kinetochordefekte zurückgehen, können auf zwei verschiede Arten erklärt werden: Erstens können Kinetochorproteine als spindelstabilisierende MAPs (Microtubuli assozierte Proteine) wirken. Zweitens treten Spindeldefekte auch dann auf, wenn eine Trennung der Spindelpole in Abwesenheit von Esp1 und Cdc14 Aktivität erfolgt. Folgende experimentelle Befunde weisen darauf hin, dass der Spindeldefekt in ame1-2 nicht auf die genannten Ursachen zurückzuführen ist, sondern vielmehr auf eine alternative Funktion des Kinetochors: • Ame1 befindet sich nicht an der mitotischen Spindel und ist folglich kein MAP. •Wie erwähnt ist die ame1-2 Mutante nicht in der Lage eine stabile bipolare Anheftung zu erreichen, was zu einer Trennung der Spindelkörper führt. Gleichzeitig hält die Mutante einen aktiven Spindel-Checkpoint aufrecht, der eine Aktivierung von Esp1 und Cdc14 verhindert. Wie beschrieben (Higuchi and Uhlmann, 2005), können diese Art von Spindeldefekten durch Überexpression von Esp1 oder Cdc14 aufgehoben werden. Die Hauptursache für den Spindeldefekt in ame1-2 ist jedoch nicht die Trennung von Spindelkörpern in Anwesenheit von geringer Esp1 und Cdc14 Aktivität: i) Eine Überexpression von Cdc14 in ame1-2 rettet den Spindeldefekt der Mutanten nicht. ii) Eine Überexpression von Esp1 in ame1-2 führt nur zu einer teilweisen Rettung des Spindeldefektes. iii) Auch eine Inaktivierung des Spindel-Checkpoints durch Depletion von Mad2 führt nur zu einer teilweisen Rettung des Spindeldefektes. iv) Eine beträchtliche Anzahl von Zellen trennt ihre Spindelpolkörper in Anwesenheit von aktivem Esp1; weist aber dennoch einen Spindeldefekt auf. v) Die meisten Spindeldefekte treten bei einer Entfernung zwischen den Spindelpolen auf, die charakteristisch für eine Metaphase ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die Spindelstabilität jedoch unabhängig von der Anwesenheit und Aktivität von Esp1. • Der ame1-2 Kinetochordefekt ist stärker ausgeprägt, wenn die Mutation vor der Ausbildung einer bipolar Anhäftung induziert wird. Diese unterschiedliche Beeinträchtigung der Kinetochorstruktur in ame1-2 spiegelt sich anscheinend in den abgeleiteten Kinetochorefunktionen wider. Ähnliche Kinetochordefekte (monopolare Segregation, Aufhebung der Freisetzung von Cdc14) werden unabhängig davon beobachtet, ob die Mutation vor oder nach einer bipolaren Anheftung induziert wird. Jedoch tritt nur im letzteren Fall ein mit dem Wildtyp vergleichbarer Zusammenbau von Meta- und Anaphasespindeln auf. Folglich könnte eine bestimmte Kinetochorstruktur (die den Mtw1 Komplex mit einschließt) an der Erzeugung eines spindelstabilisierenden Faktors beteiligt sein. 3. Gegenwärtige Vorstellungen zur Struktur des S. cerevisiae Kinetochors wurden in der vorliegenden Arbeit wie folgt erweitert: •Ein direktes Interaktionsnetzwerk zwischen den Okp1/Mtw1/Spc105/Ndc80 Kinetochorkomplexen konnte durch in vitro Bindungsexperimente identifiziert werden. •In Zusammenhang mit ChIP-Analysen der ame1-2 Mutante belegen diese Daten eine Abhängigkeit der Centromer-Assoziation aller anderen zentralen und äußeren Kinetochorkomplexen vom Okp1 Komplex und ordnen diesen Komplex folglich in die unmittelbare Nachbarschaft des DNA-bindenden CBF3 Komplexes ein. •Wenn bipolare Anheftungen jedoch vor der Induktion von ame1-2 erreicht werden, ist die Lokalisierung des Mtw1 Komplexes unabhängig von der Anwesenheit des Okp1 Komplexes. Die funktionelle Charakterisierung von Ame1 in Verbindung mit der biochemischen Bestimmung von Intra-Kinetochorwechselwirkungen ermöglichte somit eine Optimierung des gegenwärtigen Kinetochormodells. Außerdem wurde ein direkter Einfluss des Kinetochores auf die Spindelstabilität aufgezeigt, welcher vermutlich der Gegenwart des Mtw1 Komplexes zugeschrieben werden kann.