German Title: Verstärkung der Immunantwort gegen MHC Klasse defiziente Tumore: Die Rolle der regulatorischen T-Zellen und Typ I IFN

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Abstract

Naturally occurring CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Treg) have been shown to suppress immune responses, including anti-tumor immunity. Strategies of manipulating Treg in cancer patients are currently evaluated in clinical trials with the aim of enhancing the efficiency of vaccinations, targeting the adaptive arm of immunity. Many tumors, however, lose expression of MHC class I and thus become protected from CD8+ T cell-mediated recognition and elimination. Such types of tumors can still be efficiently eliminated by cells of the innate immune system, in particular NK cells, through antigen- and MHC class I-independent mechanisms. The role of Treg in the rejection of tumors, which are predominantly under the control of innate immune cells has been poorly addressed so far. In this study, we investigated the influence of Treg on the immune response against the MHC class I-deficient mouse lymphoma RMA-S after subcutaneous injection. We showed that Treg accumulate in the tumor tissue and lymphoid organs of tumor-bearing animals. Treg depletion upon application of an anti-CD25 monoclonal antibody led to the rejection of high tumor cell numbers, which in contrast grew progressively in untreated mice. Our experiments demonstrated that NK1.1+ cells, CD8+ and CD4+CD25- T cells are recruited in high cell numbers to the tumor site in the absence of Treg and that all of these three cell populations contribute to RMA-S tumor rejection. Primary immune responses elicited during Treg depletion led to the generation of protective immunological memory; rechallenge of mice that had rejected the initial tumor with either RMA S or MHC class I-sufficient RMA tumor cells resulted in immediate tumor rejection. Furthermore, we showed that IFN-γ is produced in higher amounts by the tumor-infiltrating lymphocytes in the absence of Treg. Neutralization of IFN-γ completely abrogated the tumor rejection observed after Treg depletion, which correlated with the inhibition of accumulation of leukocytes at the tumor site. Among the tumor-infiltrating leukocytes, macrophages constituted the major cell population infiltrating the RMA-S tumor tissue in the absence of Treg. Tumor-infiltrating macrophages from Treg depleted mice expressed increased amounts of MHC class II and produced highly enhanced levels of chemokines and pro-inflammatory cytokines as compared to control mice. Macrophages isolated from the tumors also inhibited tumor cell proliferation through a mechanism independent of iNOS, PGE2 and IDO. In conclusion, this study supports a role for Treg in blunting the immune response to a MHC class I-deficient tumor target, by interfering with leukocyte accumulation at the tumor site. In addition, high numbers of activated tumor-infiltrating macrophages correlated with tumor rejection in the absence of Treg. These data identify macrophages as novel potential targets for Treg mediated immune suppression in cancer. In the second part of this study, we aimed at defining further mechanisms controlling the immune response against the MHC class I-deficient RMA-S tumor. For this purpose, we focused on the role of endogenously produced type I IFN. Although exogenously administered type I IFN have been used to treat various types of cancer, their endogenous production and function during an anti-tumor response has not been extensively studied. We studied the growth of RMA-S tumor in mice that cannot respond to type I IFN (IFNAR1-/- mice) and observed an acceleration in the tumor growth. In addition, we prepared bone marrow chimeras in which either the hematopoietic or the non-hematopoietic cells cannot respond to type I IFN and we found that type I IFN responsiveness is required in both compartments. Namely, IFNAR1 was important for NK cell cytotoxicity and proper development of the vessel network in the tumor tissue. In contrast, its absence did neither affect macrophage effector functions nor accumulation of leukocytes within the tumor tissue. In summary, endogenously produced type I IFN contribute to the control of the MHC class I deficient RMA-S tumor growth, via targeting both the hematopoietic and non-hematopoietic compartments, and regulate NK cell activity and tumor vessel formation.

Translation of abstract (German)

Natürlich vorkommende CD4+CD25+Foxp3+ regulatorische T Zellen (Treg) besitzen die Fähigkeit, Immunantworten, wie z.B. die Tumorabwehr, zu unterdrücken. In klinischen Studien in Krebspatienten wird gegenwärtig untersucht, ob durch Manipulation der Treg Population die Wirksamkeit von Vakzinen, deren Ziel die Stärkung des adaptiven Immunsystems ist, gesteigert werden kann. Viele Tumore verlieren jedoch die Expression von MHC Klasse I Molekülen, die zur direkten Erkennung und Eliminierung durch CD8+ T Zellen führen. Eine effiziente Beseitigung dieser Art von Tumoren kann allerdings durch Zellen des angeborenen Immunsystems erfolgen, die nicht auf die Erkennung von Antigen-MHC Klasse I Komplexen angewiesen sind. Die Funktion regulatorischer T Zellen in der Abwehr von Tumoren, deren Wachstum überwiegend durch das angeborene Immunsystem kontrolliert wird, ist bislang nur sehr wenig erforscht. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von Treg auf die Immunantwort gegen subkutan injizierte RMA-S Zellen untersucht. RMA-S Zellen sind Maus-Lymphom-Zellen, die nur eine geringe MHC Klasse I Expression aufweisen. Unsere Experimente zeigten, dass sich Treg im Tumorgewebe sowie in den lymphoiden Organen Tumor-tragender Mäuse anreichern. Die Depletion von Treg mittels eines monoklonalen anti-CD25 Antikörpers ermöglichte die Abstoßung großer Mengen injizierter RMA-S Zellen, die in unbehandelten Mäusen zu progressivem Tumorwachstum führten. In Abwesenheit von Treg wurde eine sehr hoher Anzahl an NK1.1+, CD8+ und CD4+CD25+ T Zellen in das Tumorgewebe rekrutiert. Alle diese Zellpopulationen waren an der Abstoßung von RMA-S Tumoren beteiligt. Die in Abwesenheit der Treg ausgelöste primäre Immunantwort führte zur Entstehung von immunologischem Gedächtnis; In Mäusen, die den ursprünglichen Tumor abgestoßen hatten und anschließend erneut mit entweder RMA-S oder MHC Klasse I exprimierenden RMA Zellen injiziert wurden, wurde Tumorabstoßung beobachtet. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass Tumor-infiltrierende Leukozyten nach Depletion von Treg IFN- in größeren Mengen produzierten. Eine Neutralisation von IFN- hemmte die Anreicherung von Leukozyten im Tumor und verhinderte die normalerweise nach Treg Depletion beobachtete Tumorabstoßung. In Abwesenheit von Treg stellten Makrophagen die größte Zell-Population unter den Tumor-infiltrierenden Leukozyten dar. Makrophagen, die in Tumore Treg-depletierter Mäuse eingewandert waren, zeigten eine verstärkte Expression von MHC Klasse II und eine gesteigerte Produktion von Chemokinen und Entzündungs-fördernden Zytokinen. Diese Makrophagen waren in der Lage die Proliferation von Tumorzellen durch einen Mechanismus zu unterbinden, der unabhängig von iNOS, PGE2 und IDO war. Diese Arbeit untermauert somit die Bedeutung von Treg für die Hemmung der Immunantwort gegen Tumorzellen mit geringer MHC Klasse I Expression. In Abwesenheit von Treg bestand zudem eine Korrelation zwischen einer hohen Anzahl Tumor-infiltrierender Makrophagen und der Abstoßung des Tumors. Diese Daten beschreiben zum ersten Mal dass in Tumor-tragenden Mäusen Makrophagen durch Treg gehemmt werden können. Der zweite Teil dieser Arbeit diente der Untersuchung weiterer Kontrollmechanismen der Immunantwort gegen RMA-S Tumore. Hierbei konzentrierten wir uns auf die Bedeutung von endogen produzierten Typ I Interferonen. Obwohl die exogene Applikation von Typ I Interferonen bereits zur Behandlung verschiedener Krebsarten angewandt wird, ist ihre endogene Produktion und Funktion nur sehr wenig erforscht. In diesen Experimenten untersuchten wir das Tumorwachstum von RMA S Tumoren in IFNAR1-/- Mäusen, die nicht auf Typ I Interferone reagieren können, da sie keinen Rezeptor für Typ I Interferone exprimieren. In IFNAR1-/- Mäusen stellten wir ein beschleunigtes Tumorwachstum fest. Wir generierten Knochenmark-Chimären, in denen entweder die hämatopoetischen oder die nicht-hämatopoetischen Zellen unfähig waren auf Typ I Interferon zu reagieren und beobachteten, dass die Fähigkeit zur Reaktion auf Typ I Interferone in beiden Zellpopulationen gegeben sein muss. Der IFNA-Rezeptor zeigte sich insbesondere für die zytotoxische Aktivität von NK Zellen und für eine fehlerfreie Entwicklung von Blutgefäß-Netzwerken verantwortlich. Im Gegensatz hierzu beeinträchtigte seine Abwesenheit weder die Effektorfunktionen von Makrophagen noch die Anreicherung von Leukozyten im Tumorgewebe. Zusammenfassend zeigten unsere Studien, dass endogen produzierte Typ I Intereferone einen Beitrag zur Kontrolle des Wachstums von RMA-S Tumoren ohne MHC Klasse I Expression leisten. Dies könnte durch Beeinflussung sowohl der hämatopoetischen wie auch der nicht-hämatopoetischen Zellen und durch Regulation der Aktivität von NK Zellen und der Bildung Tumor-versorgender Blutgefäße geschehen.