German Title: Die Funktion von Tumor-infiltrierenden MDSC Subpopulationen während der Tumorentwicklung

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Abstract

Several mechanisms have been proposed for profound immune impairments that accompany tumor development. Alteration in myelopoiesis that occur during tumor growth leads to the accumulation and recruitment of immunosuppressive cells, known as myeloid-suppressor cells (MDSCs). MDSCs have been characterized in cancer patients and tumor bearing mice based on their ability to suppress T cell responses. During tumor progression MDSCs accumulate in bone marrow, blood, peripheral lymphoid organs and in the tumor tissue. They represent a heterogeneous population of myeloid cells at different stages of differentiation. In mice these cells are characterized by the co-expression of the surface markers Gr-1 and CD11b. Within this population, two distinct MDSC subpopulations with clear morphological differences have been identified, comprising mononuclear cells (MO-MDSCs), which express Ly6C and the macrophage marker F4/80, and polymorphonuclear cells (PMN-MDSCs), which express Ly6G and do not display F4/80 surface expression. The aim of this thesis was to determine the distribution of tumor-infiltrating and blood MDSC subsets as well as the molecular signature and function of genes differently regulated in MDSC subpopulations. We demonstrated that after subcutaneous injection of RMA-S tumor cells, both MDSC subsets accumulated in the tumor tissue. Gene expression profiling of blood and tumor-infiltrating MDSCs using whole genome microarrays revealed profound changes in the transcription profile between MDSC subsets in blood and tumor. Tumor-infiltrated MO-MDSCs displayed increased expression of genes involved in suppression, inflammatory responses and chemotaxis compared to blood MDSCs. We confirmed that differentially regulated genes at mRNA level were also differently expressed at protein levels and might play a significant role in MDSC function. In addition, tumor-infiltrating MDSCs showed an increased surface expression of TLR-4, CD14, and Dectin-2, suggesting a pro-inflammatory phenotype of these subsets in the tumor tissue. Stimulation of the CD14/TLR-4 complex with LPS resulted in an upregulation of the NKG2D ligand Rae-1, which might be involved in natural killer cell activation. Compared to blood MDSCs, the activity of suppressive factors such as arginase-1 and iNOS was increased in tumor-infiltrating MO-MDSCs. In addition, we observed that only tumor-infiltrating MO-MDSCs expressed high amount of several chemokines including three ligands of the chemokine receptor CCR5: CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β) and CCL5 (RANTES). Intra-tumoral injection of these recombinant chemokines resulted in an increased accumulation of regulatory T cells and a lower CD8+/Treg ratio in the tumor tissue correlated with accelerated tumor growth and shortened survival of tumor-bearing mice. On the contrary, CCR5 deficient mice injected with RMA-S tumor cells showed reduced tumor growth and prolonged survival associated with high numbers of CD4+ and CD8+ T cells and an increased CD8+/Treg ratio detected in the tumor. In summary, we demonstrated that tumor-infiltrating MO-MDSCs exerted key features to promote tumor progression. Increased expression of suppressive factors by MO-MDSC in the tumor tissue might directly downmodulate T cell responses, whereas chemokine secretion might induce the accumulation of tumor-infiltrating regulatory T cells, resulting in additive immune suppression. Those findings defined a new regulatory role of MDSCs in recruiting Tregs, which might be clinically relevant in developing novel immunotherapeutic strategies for cancer patients.

Translation of abstract (German)

Während der Tumorentwicklung führen eine Vielzahl an Mechanismen zur verstärkten Immunsuppression. Hierzu gehören Veränderungen in der Myelogenese, die zur Anreicherung und Rekrutierung von Suppressionszellen führen, auch bezeichnet als „Myeloide Suppressionszellen“ (MDSC = myeloid-derived suppressor cells). Ursprünglich wurden MDSCs in Tumorpatienten und Tumor-tragenden Mäusen als Zellen beschrieben, die in der Lage sind T-Zellantworten zu unterdrücken. Während der Tumorentwicklung akkumulieren MDSCs im Knochenmark, Blut, peripheren Lymphorganen und im Tumorgewebe. Sie bilden eine heterogene Gruppe aus myeloiden Zellen, die sich in verschiedenen Entwicklungsstadien befinden. Maus MDSCs sind durch ihre Koexpression der Oberflächenmoleküle Gr-1 und CD11b charakterisiert, die anhand ihrer morphologischen Unterschiede in zwei Untergruppen gegliedert werden. Während die mononukleären Zellen (MO-MDSC) die Marker Ly6C und F4/80 exprimieren, zeichnet sich die polymorphnukleäre Subpopulation (PMN-MDSC) durch eine Oberflächenexpression von Ly6G aus. Zusätzlich fehlt der PMN-MDSC Gruppe der Makrophagenmarker F4/80. Ziel unserer Studie war es, die Verteilung der einzelnen MDSC Subgruppen im Blut und Tumor zu analysieren, deren Transkriptionsprofil zu untersuchen und anhand unterschiedlich exprimierter Proteine die Funktion zu bestimmen. Unsere Untersuchungen zeigten, dass nach subkutaner Injektion von RMA-S Zellen beide MDSC Populationen in den Tumor einwanderten. Genexpressionsanalysen mittels Microarray ließen deutliche Veränderungen des Transkriptionsprofils zwischen den Untergruppen im Blut bzw. im Tumor erkennen. Verglichen zu MDSCs aus dem Blut, zeigten Tumor-infiltrierende MO-MDSCs eine erhöhte Expression von Genen, die eine wichtige Rolle in Immunsuppression, Entzündungsantworten und Chemotaxis spielen. Die meisten dieser Genveränderungen auf Transkriptionsebene konnten ebenso auf Proteinebene bestätigt werden. Tumor-infiltrierende MDSCs wiesen eine erhöhte Oberflächenexpression von TLR-4, CD14, und Dectin-2 auf, was auf einen pro-inflammatorischen Phänotyp im Tumorgewebe rückschließen lässt. Stimulierung des CD14/TLR-4 Komplexes mit LPS führte zu einer erhöhten Expression des NKG2D Liganden, Rae-1, wodurch Natürlichen Killerzellen besser aktiviert werden könnten. MO-MDSCs im Tumor zeigten eine erhöhte Aktivität von hemmenden Enzymen wie Arginase-1 bzw. iNOS verglichen zu MDSCs aus dem Blut. Zudem beobachteten wir, dass nur Tumor-infiltrierende MO-MDSCs hohe Mengen an Chemokinen produzierten. Dazu gehören drei Liganden des Chemokinrezeptors CCR5: CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β) und CCL5 (RANTES). Wiederholte Injektionen dieser rekombinanten Chemokine in den Tumor führten zur verstärkten Anreicherung von regulatorischen T-Zellen (Treg) bzw. zu einem verminderten Verhältnis von CD8+/Tregs im Tumor. Zusätzlich wurde das Tumorwachstum beschleunigt und die Überlebensrate der Mäuse verringert. Im Gegensatz dazu zeigten CCR5 defiziente Mäuse, die mit RMA-S Tumorzellen injiziert wurden, ein vermindertes Tumorwachstum und eine verlängerte Überlebensrate, was mit einer erhöhten Zellzahl an CD4+ und CD8+ T-Zellen und einem Anstieg der CD8+/Treg Ratio im Tumor korrelierte. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass Tumor-infiltrierende MO-MDSCs eine unterstützende Rolle in der Tumorentwicklung übernehmen. Die erhöhte enzymatische Aktivität von Suppressionsfaktoren kann T-Zellantworten auf direktem Weg vermindern, während sezernierte Chemokine der Tumor-infiltrierenden MO-MDSCs indirekt das Immunsystem durch Anreicherung von Tregs im Tumor schwächt. Diese Ergebnisse beschreiben eine neue regulatorische Funktion der MDSCs in der Rekrutierung von Tregs, wodurch Behandlungen zur effektiven Tumortherapie verbessert werden könnten.