English Title: Investigating genotoxicity in fish and fish cells with the single cell gel electrophoresis (comet assay) - chances and limitations in environmental monitoring -

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Abstract

In den Untersuchungen zum Comet Assay mit Fischen und Fischzellen stand die Etablierung des Systems mit primären Hepatocyten und Kiemenzellen aus dem Zebrabärbing (Danio rerio), der Vergleich der genotoxischen Wirkung nach in vitro- und in vivo-Exposition sowie die Korrelation der Ergebnisse mit anderen etablierten Testsystemen im Vordergrund. Erste Grundlagenuntersuchungen für den Einsatz mit Fischzellen wurden mit der Dauerzelllinie RTG-2 vorgenommen. Neben bekannten Mutagenen wurden unterschiedlich belastete Wasserproben von Rhein, Elbe und Neckar getestet. Im Gegensatz zu den In vitro-Untersuchungen, mit nur wenigen positiv getesteten Wasserproben, ergaben Freilandstudien in Fischen aus den untersuchten Gewässern gehäuft leichte DNA Schäden und zeigten damit die Grenzen von Kurzzeit-In vitro-Tests auf. Zur Einschätzung der biologischen Relevanz des Endpunkts DNA Strangbruch aus dem Comet Assay, wurden mit den getesteten Mutagenen der Mikrokern Test, histologische und ultrastrukturelle Untersuchungen bei belasteten Fischen und Fischzellen, Early Life Stage Tests mit dem Zebrabärbling sowie vergleichende Freilandstudien mit unterschiedlichen Fischarten durchgeführt. Diese zeigten, daß die mit dem Comet Assay abgebildeten Effekte im Bereich vielfältiger, biologisch faßbarer Wirkungen liegen. Beispielsweise wiesen die belasteten Fischlarven aus den Early Life Stage Untersuchungen deutliche Ähnlichkeiten mit Entwicklungsmutanten aus genetischen Screenings auf. Die ermittelten LC 50-Konzentrationen entsprachen Testkonzentrationen im Comet Assay, die bereits deutliche DNA-Schäden induzierten. Starke Effekte im Comet Assay konnten mit der Induktion apoptotischer Prozesse in RTG-2 Zellen nach dreitägiger Exposition korreliert werden. Abschließend kann der Comet Assay mit Dauer- und Primärzellen aus Fischen als ein wertvolles Werkzeug im Rahmen einer Testbatterie zur Ermittlung genotoxischer Effekte in der aquatischen Umwelt empfohlen werden.

Translation of abstract (English)

In the present study the single cell gel electrophoresis (comet assay) was established with fish and fish cells using primary hepatocytes and gill cells from zebrafish (Danio rerio). These primary cell culture systems were also used for in vitro – in vivo comparisons as possible tools for the detection of genotoxicity. Besides well known genotoxins like benzo[a]pyrene water samples from the Rhine, Elbe and Neckar were investigated. In contrast to the in vitro situation with only a small number of positive water samples, feral fish from the Neckar frequently displayed elevated levels of DNA fragmentation in different cell types in the comet assay compared to individuals kept under laboratory conditions. In early life stage experiments exposed embryos of zebrafish displayed high levels of malformation, retarded development and mortality after exposure to the genotoxins tested in the comet assay. Using the permanent cell line RTG-2 the induction of apoptotic processes were observed after 72 h of exposure to concentrations of 4-nitroquinoline-N-oxide inducing high levels of DNA damage after short term exposure in the comet assay. The comparison of comet assay results with those of experiments from different fields of toxicology like micronucleus tests, early life stage experiments, ultrastructural investigations of exposed organisms and cells, and environ-mental monitoring showed that the effects, measured as DNA fragmentation in the comet assay, can be associated with different biological consequences. Therefore, the comet assay with permanent and primary cells from fish is a valuable tool to be incorporated in a test bat-tery for environmental monitoring.