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URN: urn:nbn:de:bsz:16-opus-58544
URL: http://www.ub.uni-heidelberg.de/archiv/5854
Hinweis zum Urheberrecht.
Neue DNA-Biosensoren mit direkter elektrochemischer Detektion auf Basis von Metall-PNA-Konjugaten
A New class of DNA-Biosensors with Direct Electrochemical Detection Based on Metal-PNA Conjugates
Quelle:
(2005) Maurer, A., Kraatz, H.-B., Metzler-Nolte, N., Synthesis and Electrochemical Characterization of Metallocene-PNA Oligomers. Eur. J. Inorg. Chem. 2005, 3207-3210
pdf-Format:
Dokument 1.pdf (9.776 KB)
SWD-Schlagwörter:
Peptid-Nucleinsäuren , Metallocene , Elektrochemie , Elektronentransfer , Monoschicht , Ultraviolettspektroskopie , Ellipsometrie , Röntgen-Photoelekt
Freie Schlagwörter (Deutsch):
Peptid-Nukleinsäuren (PNA) , Metallocene , UV-Schmelzkurven , Elektrochemie , Fehlstellen-Analyse
Freie Schlagwörter (Englisch):
Peptide Nucleic acid (PNA) , Metallocenes , Melting behaviour , Electrochemistry , Mismatch-Detection
Institut:
Institut für Pharmazie und molekulare Biotechnologie
Fakultät:
Fakultät für Biowissenschaften
DDC-Sachgruppe:
Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart:
Dissertation
Hauptberichter:
Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte
Sprache:
Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung:
16.09.2005
Erstellungsjahr:
2005
Publikationsdatum:
25.10.2005
Kurzfassung in Deutsch:
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung neuartiger Biosensoren für die DNA-Analytik auf der Basis von Konjugaten aus Peptid-Nukleinsäure(PNA) mit kovalent gebundenen Metallocenen (Ferrocen und Cobaltocenium) beschrieben. Kommerziell erhältliche DNA-Arrays sind hinsichtlich der Erkennung von Punktmutationen in den Targets limitiert, da DNA-Oligomere als Sonden über keine ausreichend hohe Spezifität verfügen.
PNA-Oligomere hingegen hybridisieren mit komplementären DNA-Sequenzen via Watson-Crick-Basenpaarung, jedoch zeigen die Duplizes eine erhöhte Schmelztemperatur und zugleich eine gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber Fehlstellen im Vergleich zu DNA•DNA-Hybriden.
Die kovalent an die PNA gebundenen Metallocene gestatten eine elektrochemische Detektion der erfolgten Hybridisierung mittels Square-Wave-Voltammetrie (SWV) und Cyclovoltammetrie (CV). Es wurden neuartige Konjugate aus elektrochemisch aktiven Metallverbindungen und Peptidnukleinsäuren (PNA) synthetisiert und charakterisiert. Ferner wurde das Hybridisierungsverhalten mit voll-komplementärer sowie mit Fehlstellen-haltiger DNA mittels UV-Schmelzexperimenten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine
intern gelegene Fehlstelle einen weitaus größeren Destabilisierungseffekt mit sich bringt als eine terminal liegende. Ferner wurde anhand dieser Experimente das Hybridisierungsverhalten auf Oberflächen immobilisierter Hybride im Vorfeld geprüft und die Temperaturbedingungen für die elektrochemischen Messungen optimiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die PNA-Metall-Oligomere als Einzelstränge sowie als PNA•DNA-Hybride via SH-Gruppen auf die Oberfläche eigens präparierter Gold-Mikroelektroden aufgebracht. Die Oberfläche und Zusammensetzung dieser so genannten „self-assembled monolayers“ (SAMs) wurde mit Hilfe der Ellipsometrie und der Röntgen-Photo-Elektronenspektroskopie charakterisiert. Die immobilisierten Metall-PNA-Einzelstränge wurden mit voll-komplementärer und Fehlstellen-haltiger DNA
zusammengebracht und die Hybridisierung mit SWV sowie mit elektrochemischer
Impedanzspektroskopie (EIS) verfolgt. Im Sinne einer Array-Technik konnte mit Metall-PNA als Sonde auf elektrochemischem Wege zwischen voll-komplementärem und Fehlstellen-haltigem DNA-Target unterschieden werden.
Kurzfassung in Englisch:
In this thesis, the development of a new type of DNA-biosensor based on metallocene-PNA (peptide nucleic acid) conjugates is described.
Probes of DNA oligomers are lacking specificity towards point mutations. In contrast to that, PNA oligomers hybridize with complementary DNA sequences via Watson-Crick basepairing, but the hybrids show clearly higher melting temperatures (Tm) and at the same time an increase of mismatch sensitivity. The conjugation of metallocenes to PNA thus should allow the electrochemical detection of the target and discrimination towards mismatched sequences.
In the course of this thesis, the synthesis and characterization of new conjugates of PNA with ferrocene and cobaltocene, respectively, was established. The oligomers were hybridized with complementary and mismatched DNA sequences in order to examine the destabilizing effects of DNA mismatches, represented by the melting temperature, Tm. The experiments revealed the presence of an internal mismatch in DNA being much more destabilizing than an N-terminal one. Furthermore, the conditions for the experiments on the gold surface were optimized.
Single stranded metal-PNA conjugates and PNA•DNA hybrids were immobilized on goldmicroelectrodes via Au-S-linkage forming self-assembled monolayers (SAMs). Ellipsometry and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) were used to examine the composition of the surface and the interaction between the molecules. The hybridization of target sequences to immobilized, single stranded PNA oligomers was surveyed by electrochemical impedance spectroscopy (EIS), square wave voltammetry (SWV) and cyclic voltammetry (CV).
In the sense of an array technology, probes of metallocene-PNA were proven to be capable of distinguishing between fully complementary and mismatched DNA target sequences.
