German Title: Detektion schnell-diffundierender Moleküle in der Membran lebender Zellen

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Abstract

We present a novel optical scheme for the observation of the dynamics of single fluorescent molecules, with a flexible choice of high spatial localization accuracy (~10-20 nm standard deviation or ~20-40 nm full-width-at-half-maximum) and temporal resolution (<1 ms, <0.5 ms for much of a molecule trajectory). The fluorescence signal during individual passages of fluorescent molecules through a spot of excitation light allows the sequential localization and thus spatio-temporal tracking of the molecule if its fluorescence is collected on at least three separate point detectors arranged in close proximity. Time-correlated-single-photon-counting is shown to be a vital feature within this approach, allowing useful extensions in the analysis and improving signal-to-noise ratio in molecular tracking data. We show two-dimensional trajectories of individual, small organic dye labeled lipids diff using in the plasma membrane of living cells and directly observe transient events of trapping on <20 nm spatial scales. The trapping is cholesterol-assisted and much more pronounced for a sphingo- than for a phosphoglycero-lipid, with average trapping times of ~15 ms and <4 ms, respectively. The results support previous STED nanoscopy measurements and suggest that, at least for nontreated cells, the transient interaction of a single lipid is con fined to macromolecular dimensions. Our experimental approach demonstrates that molecular movements up to diffusion coefficients D~0.1-1 square microns / s can be tracked with minimal invasion, which can reveal new important details of cellular nano-organization. This is further exemplifi ed by uncovering subtle di fferences in the lateral diffusion of several membrane constituents of diff erent chemical structure. The potential of single photon detection and counting for the rapidly developing field of far- field optical nanoscopy is discussed and proof-of-principle experiments are presented in which nanoscale images are reconstructed from molecular registrations based on their complete photon statistics.

Translation of abstract (German)

Eine neue optische Methode zur Beobachtung von Dynamiken einzelner fluoreszenter Moleküle wird vorgestellt. Der Ansatz erlaubt eine hohe Flexibilität zwischen räumlicher Lokalisierungsgenauigkeit (~10-20 nm radiale Standardabweichung oder ~20-40 nm Halbwertsbreite) und zeitlicher Auflösung (<1 ms, <0.5 ms für einen großen Teil einer Molekültrajektorie). Das Fluoreszenzsignal während einzelner Durchtritte von fluoreszierenden Molekülen durch einen Fokus von Anregungslicht erlaubt die sequenzielle Lokalisierung und damit das Verfolgen des jeweils einzelnen Moleküls in Raum und Zeit, wenn das Fluoreszenzlicht auf mindestens drei getrennten, jedoch nahe beieinanderliegenden, Punktdetektoren gesammelt wird. Die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung wird als ein zentrales Mittel in dieser Methode ausgemacht: ihr Einsatz erlaubt nützliche Erweiterungen in der Analyse und verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis in den molekularen Trajektoriendaten. Wir zeigen zwei-dimensionale Trajektorien von einzelnen mit kleinem organischen Farbstoff markierten Lipiden, die in der Plasmamembran lebender Zellen diff undieren. Hierbei beobachten wir direkt den Einfluss von transientem Verweilen der Lipide auf Längenskalen <20 nm. Dieses 'Trapping' ist cholesterolabhängig und für ein Sphingolipid viel markanter ausgeprägt als für ein Phosphoglycerolipid, mit mittleren Trapzeiten von ~15 ms bzw. <4ms. Die Ergebnisse stimmen mit früheren Beobachtungen mittels STED-Nanoskopie überein und legen den Schluss nahe, dass die transiente Wechselwirkung eines einzelnen Lipids - zumindest in unbehandelten Zellmembranen - auf einen Bereich makromolekularer Größe begrenzt ist. Unser experimenteller Ansatz zeigt, dass es möglich ist, schnelle Molekülbewegungen (D~0.1-1 Quadratmikrometer / s) minimalinvasiv zu verfolgen. Dies kann wichtige neue Details zellulärer Nanoorganisation sichtbar machen. Als wichtige Belege dafür werden Details des sich unterscheidenden Diff usionsverhaltens von Membranmolekülen unterschiedlicher chemischer Struktur aufgezeigt. Das Potenzial der Einzelphotonenzählung für die sich rapide entwickelnde fernfeldoptische Nanoskopie wird diskutiert. Wir präsentieren in diesem Zusammenhang Experimente, in denen Bilder mit Nanometerauflösung aus der Detektion einzelner Moleküle anhand ihrer vollständigen Photonenstatistik rekonstruiert werden.