German Title: Genetische Analyse des emotionalen Gedächtnisses in AMPA- und NMDA-Rezeptor-Mutantmäusen

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Abstract

My goal was to study the role of AMPA and NMDA receptors in fear memory using genetic tools. In particular, I aimed to unravel the function of these glutamate receptors in the long-term retrieval of passive avoidance and fear conditioning, both in the brain in general and in the Basolateral Amygdala (BLA). Through the analysis of GluA3 knockout mice, I could show that the AMPA receptor subunit GluA3 is not necessary for the initial phases of cued fear learning, but is required for the normal attenuation of fear to a remote negative event, both in the passive-avoidance and fear-conditioning paradigms. In contrast, GluA1 is essential for the acquisition and short-term retrieval of cue- and context-induced fear. Two gene-targeted mouse lines were used, one with a global GluA1 knockout, and a ”loss of function“ mutant GluA1 (Q586R). Both lines showed impaired acquisition and reduced cue- and context-induced retrieval 24 h and 48 h after fear conditioning, supporting the hypothesis of involvement of GluA1-containing AMPA receptors in learning of emotional associations. Moreover, in a similar way as for GluA3, GluA1 is also required for the normal decrease of fear to remote events in the passive avoidance test, suggesting that both subunits play an important role in the normal destabilization of older memories such as those that no longer provide an advantage in survival. To study AMPA and NMDA receptor function specifically in the retrieval phase of fear conditioning, I used inducible recombinant adeno-associated virus (rAAV)-mediated gene manipulations in the amygdala. The efforts to generate a BLA-specific promoter for rAAV failed. Therefore a doxycycline-inducible neuron-specific system was used for synaptic silencing of neurons in the amygdala, and to inactivate NMDA and GluA1-containing AMPA receptors in the BLA. Altogether, the analysis of rAAV-injected mice provided strong evidence that retrieval of cued fear memory is dependent on the chronic expression of NMDA receptors in the BLA, whereas the contribution of the GluA1-containing AMPA receptors remains to be confirmed. In the second part of this thesis, I generated and analyzed a new rAAV vector for tissue-specific gene delivery. A new endogenous promoter was cloned from the murine lynx2 gene, a member of the Ly-6/neurotoxin superfamily, for overexpression of genes in dentate gyrus granule cells. This virus can be used to further restrict rAAV-mediated targeting to certain groups of cells.

Translation of abstract (German)

Die vorliegende Arbeit beschreibt neue gentechnisch unterstützte Untersuchungen zur Funktion von AMPA- und NMDA-Rezeptoren im Gehirn und insbesondere der basolateralen Amygdala (BLA) von Mäusen beim Erlernen und bei der Ausprägung emotionaler Erinnerungen. In Verhaltensstudien an GluA3-Knockout Mäusen konnte ich zeigen, dass AMPA-Rezeptoren, welche die Untereinheit GluA3 tragen, für eine Angstkonditionierung nicht benötigt werden. Allerdings sind diese Rezeptoren für eine allmähliche Attenuierung der Angstreaktion bezüglich einer ursprünglich erworbenen negativen Erfahrung notwendig, wie Messungen des passiven Vermeidungsreflexes als auch der Angstreaktion auf den negativ assoziierten Reiz einige Wochen nach der Konditionierung belegen können. Im Gegensatz dazu sind die GluA1-haltigen AMPA-Rezeptoren für das Erlernen und Memorieren reiz- und kontext-konditionierter Angst essentiell. Dies zeigen Verhaltensstudien mit globalen GluA1-Knockout- Mäusen als auch mit den „Loss of Function“ GluA1 (Q586R)-Mutanten. In beiden Mauslinien ist eine verminderte Lernfähigkeit und eine deutlich reduzierte reiz- bzw. kontext-induzierte Angstreaktion 24 und 48 Stunden nach der Konditionierung nachweisbar, was auf eine Beteiligung von GluA1(Q) haltigen AMPA-Rezeptoren beim effektiven Erlernen emotionaler Assoziationen hinweist. Außerdem werden die GluA1 als auch GluA3 im AMPA-Rezeptorkomplex für die normale Abschwächung traumatisierter Angst, die im passiven Vermeidungstest quantifiziert wurde, benötigt. Dies deutet darauf hin, dass beide Untereinheiten bei der Destabilisierung älterer Erinnerungen, wie z. B. solcher, die keine Überlebensvorteile mehr verleihen, eine wichtige Rolle spielen. Um die Funktion von AMPA- und NMDA-Rezeptoren bei der Reaktion auf einen konditionierten Reiz zu untersuchen, wurden induzierbare Genmanipulationen in der Amygdala mit Hilfe von rekombinanten adeno-assoziierten Viren (rAAV) durchgeführt. Da es nicht möglich war einen BLA-spezifischen Promotor für rAAV zu generieren, wurde ein Doxycyclin induzierbares System benutzt, um die synaptische Aktivität von Neuronen in der Amygdala auszuschalten und um NMDA- und GluA1-enthaltende Rezeptoren in der BLA zu inaktivieren. Die Analyse der rAAV-infizierten Mäuse lieferte erste starke Hinweise für eine Beteiligung der NMDA-Rezeptoren bei der Erinnerung an einen lange zurückliegenden konditionierten Stimulus und somit einen Beweis, dass chronische NMDA-Rezeptorexpression für den langfristigen Erhalt einer negativen emotionalen Erfahrung notwendig ist. Die Mitwirkung von GluA1-enthaltenden AMPA-Rezeptoren konnte nicht eindeutig gezeigt werden. Im zweiten Teil meiner Dissertation generierte und analysierte ich einen neuen rAAV-Vektor für gewebespezifische Genexpression. Genfragmente aus der Promotorregion des lynx2-Gens wurden isoliert, um mit deren Hilfe die Überexpression von rAAV-transduzierten Genen in den Körnerzellen des Gyrus dentatus zu ermöglichen. Ein aus diesen Studien resultierendes neues Virus ermöglicht die Eingrenzung eines rAAV-vermittelten Gentransfers auf bestimmte neuronale Zellpopulationen.