German Title: Neue Stimulus-reaktive Substrate zur dynamischen Kontrolle raum-zeitlicher Muster sowie Entwicklung von Stammzellen durch physikalische Signale

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Abstract

Biological cells sense not only biochemical cues but also physical cues from the surrounding microenvironment, and adapt their function and fate. Ample evidence suggests that changes in physical microenvironments of cells play critical roles in development, aging and diseases. However, the understanding of the dynamic response of cells to abrupt changes in physical microenvironments is still incomplete due to a lack of substrates that can provide well defined physical commands. The main thrust of this thesis is the design of two new types of substrates, which dynamically change elasticity or topography in order to unravel dynamic cellular response far out of equilibrium. Chapter 4 presents the design of substrates with periodic wrinkles of adjustable wavelength for the switching of morphology and orientational order of mouse myoblasts. The substrates used in this study were fabricated by the deposition of hard polyimide on soft polydimethylsiloxane under axial strain. In stark contrast to commonly used approaches in topographic control of cells under static conditions (static contact guidance), the wrinkled substrates designed in this study are able to reversibly switch the wrinkle direction by 90° within 60 s simply by axial compression and relaxation. Dynamic contact guidance introduced in this study unraveled the kinetics of shape adaptation and orientational orders of cells as well as the existence of a critical wavelength for rearrangement of the focal adhesions and remodeling of cytoskeletons in response to the abrupt change in wrinkle direction. Chapter 5 deals with the establishment of hydrogel substrates that can reversibly change the bulk elastic modulus for regulation of the morphology, active force generation and the fate decision of human mesenchymal stem cells derived from the bone marrow. The uniqueness of this study is to use hydrogels with reversible host-guest interactions, whose elasticity can be adjusted by the concentration of free host or guest molecules. In contrast to commonly used, chemically crosslinked hydrogel substrates with fixed elastic moduli, this enables to fine-adjust the substrate elasticity as well as to abruptly switch the substrate elasticity at any given time point. The mechanical strength of cell adhesion determined from a self-developed, high-throughput assay utilizing shock waves as well as the total energy dissipation by cellular traction forces indicated the presence of a critical substrate elasticity which triggers the mechanosensory system. Remarkably, an abrupt softening of substrate stiffness across this threshold instantaneously led to a decreasing total strain energy. Furthermore, frequent exchange of the substrate elasticity resulted in decreased proliferation without interfering with the multipotency of stem cells. The dynamic cellular microenvironments established in this study open the new possibility to gain insight into the physical mechanism underpinning the plasticity of life, such as development, aging, and diseases.

Translation of abstract (German)

Biologische Zellen nehmen nicht nur biochemische, sondern auch physikalische Reize aus ihrer Mikroumgebung wahr. Zahlreiche Anhaltspunkte weisen darauf hin, dass Veränderungen der physikalischen Mikroumgebung von Zellen eine kritische Rolle in Prozessen wie Wachstum, Alterung und Erkrankung spielen. Bisher ist das Verständnis der dynamischen Reaktion von Zellen auf spontane Änderungen der physikalischen Mikroumgebung weitgehend unzureichend, da Substrate fehlen, welche klar definierte physikalische Signale erzeugen können. Der Hauptbestandteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung zweier Arten von Substraten, deren elastische und topographische Eigenschaften dynamisch verändert werden können, um die dynamische Reaktion der Zellen weit außerhalb eines physikalischen Gleichgewichts zu verstehen. In Kapitel 4 wird das Design eines Substrats mit periodischen Falten von regulierbarer Wellenlänge vorgestellt, welches ermöglicht das Erscheinungsbild und die kollektive Orientierung von Mausmyoblasten zu kontrollieren. Dieses Substrat wurde durch die Ablagerung von hartem Polyimid auf weichem Polydimethylsiloxan unter axialer Stauchung hergestellt. Im Gegensatz zu allgemein üblichen Herangehensweisen zur statischen, topographischen Manipulation von Zellen (statische Kontaktführung), bietet das in dieser Studie vorgestellten Substrat die Möglichkeit, die Orientierung der Falten innerhalb von 60 Sekunden durch axiale Stauchung reversibel um 90° zu drehen. Des Weiteren wird in dieser Arbeit die dynamische Kontaktführung eingeführt, welche zur Untersuchung der Reaktion von Zellen auf spontane Änderung der Faltenausrichtung sowohl die Kinetik der Formanpassung und der kollektiven Orientierung der Zellen betrachtet, als auch die Existenz einer kritischen Wellenlänge nachweist, bei der die Neuanordnung der fokalen Adhäsionen und des Zytoskeletts stattfindet. Kapitel 5 behandelt die Etablierung eines Hydrogel-Substrats, dessen Elastizität zur Regulierung von Erscheinungsbild, aktiver Kraftausübung und Differenzierung menschlicher mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark reversibel verändert werden kann. Einzigartig an dieser Studie ist die Verwendung eines Hydrogels mit reversiblen Wirt-Gast-Interaktionen, dessen Elastizität durch die Konzentration freier Wirt- oder Gastmoleküle gesteuert werden kann. Im Gegensatz zu häufg verwendeten chemisch vernetzten Hydrogelsubstraten mit fester Elastizität erlaubt dieses die Feineinstellung der Substratelastizität sowie deren spontane Änderung zu einem beliebigen Zeitpunkt. Die mechanische Kraft der Zelladhäsion wurde mit einem selbst entwickelten Messsystem bestimmt, das durch den Einsatz von laserinduzierten Schockwellen eine hohe Durchsatzrate erlaubt. Die so ermittelte Adhäsionsstärke und totale Energiedissipation durch zelluläre Traktionskräfte deuteten auf eine kritische Substratelastizität hin, welche das mechanosensorische System der Zelle aktiviert. Bemerkenswert ist, dass eine spontane Reduktion der Elastizität über diese Grenze zu einer sofortigen Verringerung der totalen Verzerrungsenergie führte. Des Weiteren führte der wiederholte Wechsel der Substratelastizität zu einer Reduktion der Proliferation, ohne die Multipotenz der Stammzellen zu beeinflussen. Die dynamische Mikroumgebung für Zellen, welche in dieser Studie eingeführt wurde, ermöglicht neue Einblicke in die physikalischen Mechanismen von beispielsweise Zellentwicklung, Alterung und Erkrankung, welche die Plastizität des Lebens untermauern.