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Abstract

H-1 protoparvovirus (H-1PV) is a self-propagating virus, non-pathogenic in humans, endowed with oncolytic and oncosuppressive activities. H-1PV is the only member of the Parvoviridae family to be tested as an anticancer agent in a clinical setting. Results from clinical trials in patients with glioblastoma or pancreatic carcinoma showed that virus treatment is safe and well-tolerated. Virus treatment was associated with first signs of efficacy, including immune conversion of tumour microenvironment, good virus distribution in the tumour bed, as well as improved patient overall survival compared with historical controls. However, monotherapeutic use of the virus was not sufficient to eradicate the tumours. In this manner, my approach consists of further understanding the virus life cycle in order to improve H-1PV-based anticancer therapies. This knowledge can provide hints on which drugs or treatment modalities could be combined with the virus in order to enhance its oncotoxicity. In addition, a deeper understanding of H-1PV life cycle can help to identify biomarkers capable of predicting which patients would most likely benefit from virus treatment. To achieve this goal, previous members of the laboratory performed a druggable genome-wide siRNA library screening to identify putative modulators of H-1PV infection. Focusing on cellular factors potentially involved at the early steps of H-1PV infection, three top activators were identified: LAMC1, LGALS1 and AP2M1. (i) Laminin containing the γ1 chain, encoded by LAMC1, had previously been demonstrated to play a pivotal role at the level of binding and entry into cancer cells. Building on these results, I provide direct evidence that H-1PV binds to laminins through the sialic acid moieties present in these molecules. (ii) Galectin-1, encoded by LGALS1, is here shown to interact directly with H-1PV at the cell surface and promote the efficient virus internalisation into cancer cells. Knock-down/out of LGALS1 strongly decreases the ability of H-1PV to infect and kill cancer cells. These properties are rescued by the re-introduction of LGALS1 into cancer cells. The in silico analysis reveals that LGALS1 is overexpressed in glioblastoma and pancreatic carcinoma. In collaboration with Dr. Miletic (University of Bergen, Norway), we also show by immunohistochemistry analysis on 122 glioblastoma biopsies that galectin-1 protein levels vary across the different tumours with higher levels detected in glioblastoma than normal tissues, and higher in recurrent in comparison with primary glioblastoma tumours. We also found a direct correlation between LGALS1 transcript levels and H-1PV oncolytic activity in 59 cancer cell lines from different tumour origins. Together these results suggest that tumours with higher galectin-1 content may be a more suitable target for H-1PV. Strikingly, the addition of purified galectin-1 sensitises poorly susceptible glioma cell lines to H-1PV killing activity by rescuing virus cell entry. (iii) AP2μ1, encoded by AP2M1, is a subunit from the adaptor 2, a key regulator of clathrin-mediated endocytosis. Indeed, siRNA-mediated knockdown of AP2M1 or chemical inhibition of clathrin-mediated endocytosis strongly decreased H-1PV entry. Using electron and confocal microscopy, H-1PV particles were detected within clathrin-coated pits and vesicles, further corroborating that H-1PV uses clathrin-mediated endocytosis for cell

x entry. In contrast, I observed no evidence of viral entry through caveolae-mediated endocytosis. I also show that H-1PV internalisation depends on dynamin activity, and that viral trafficking occurs from early to late endosomes, with low endosomal pH required for a successful infection. Based on the body of evidence gathered during this dissertation, I propose a model where H-1PV binds to the sialic acid present in laminins containing γ1 chains, and then galectin-1 promotes the efficient internalisation of virus particles through clathrin-mediated endocytosis. For the first time, this dissertation describes the cell entry pathways of oncolytic H-1PV.

Translation of abstract (German)

Das H-1-Protoparvovirus (H-1PV) ist ein sich selbst vermehrendes Virus, das für den Menschen nicht pathogen ist und über onkolytische und onkosuppressive Aktivitäten verfügt. H-1PV ist das einzige Mitglied der Familie Parvoviridae, das in einem klinischen Umfeld als Antikrebsmittel getestet wurde. Ergebnisse aus klinischen Studien bei Patienten mit Glioblastom oder Pankreaskarzinom zeigten, dass die Virusbehandlung sicher und gut verträglich ist. Die Virusbehandlung zeigte erste Anzeichen einer Wirksamkeit, einschließlich einer Immunumwandlung der Tumormikroumgebung, einer guten Virusverteilung im Tumorbett sowie einer Verbesserung der Gesamtüberlebenszeit der Patienten im Vergleich zu historischen Kontrollen. Die alleinige Anwendung des Virus als Therapie reichte jedoch nicht aus, um die Tumore zu eliminieren. Dahingehend

möchte ich versuchen, den Lebenszyklus des Virus besser zu verstehen, um die auf H- 1PV-basierenden Krebstherapien zu verbessern. Dieses Wissen kann Hinweise darauf

geben, welche Medikamente oder Behandlungsmodalitäten mit dem Virus kombiniert werden können, um dessen Onkotoxizität zu erhöhen. Darüber hinaus kann ein tieferes Verständnis des H-1PV-Lebenszyklus dazu beitragen, Biomarker zu identifizieren, die vorhersagen können, welche Patienten am wahrscheinlichsten von einer Virusbehandlung profitieren würden. Um dieses Ziel zu erreichen, hatten ehemalige Mitglieder des Labors ein medikamentöses genomweites Screening einer siRNA-Bibliothek durchgeführt, um mutmaßliche Modulatoren der H-1PV-Infektion zu identifizieren. Mit einem

Schwerpunkt auf zelluläre Faktoren, die möglicherweise an der frühen Phase der H-1PV- Infektion beteiligt sind, wurden drei Top-Aktivatoren identifiziert: LAMC1, LGALS1 und

AP2M1. (i) Es wurde zuvor gezeigt, dass Laminin, das eine γ1-Kette enthält (codierte durch LAMC1), eine entscheidende Rolle beim Andocken und Eintreten des Virus an und in die Krebszellen spielt. Aufbauend auf diesen Ergebnissen zeige ich, dass H-1PV über Sialinsäuren, die in diesen Molekülen vorhandenen sind, an Laminine bindet. (ii) Es wird hier gezeigt, dass Galectin-1, das von LGALS1 codiert wird, direkt mit H-1PV an der Zelloberfläche interagiert und die effiziente Virusinternalisierung in Krebszellen

unterstützt. Durch den Knockout/Knockdown von LGALS1 wird die Fähigkeit von H- 1PV, Krebszellen zu infizieren und abzutöten, stark verringert. Diese Eigenschaften

werden durch die Wiedereinführung von LGALS1 in Krebszellen wiederhergestellt. Eine in silico Analyse zeigt, dass LGALS1 beim Glioblastom und Bauchspeicheldrüsenkarzinom überexprimiert wird. Zudem zeigen wir in Zusammenarbeit mit Dr. Miletic (Universität Bergen, Norwegen) durch immunhistochemische Analyse von 122 Glioblastom-Biopsien, dass die Proteinspiegel von Galectin-1 in den verschiedenen Tumoren variieren, wobei im Glioblastom ein höherer Gehalt an Galectin-1 als in normalen Geweben nachgewiesen wurde und die Expression von Galectin-1 in rezidivierenden Tumoren höher im Vergleich zu primären Glioblastomtumoren ist. Wir fanden auch eine direkte Korrelation zwischen den LGALS1- Transkriptmengen und der onkolytischen Aktivität von H-1PV in 59 Krebszelllinien unterschiedlicher Tumorherkunft. Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass Tumore mit einem höheren Gehalt an Galectin-1 ein geeigneteres Ziel für H-1PV sein könnten. Bemerkenswerterweise sensibilisiert die Zugabe von gereinigtem Galectin-1 schlecht-anfällige Gliomzelllinien für die abtötende Wirkung von H-1PV, indem der

xii Eintritt des Virus in den Zellen wiederhergestellt wird. (iii) AP2μ1, codiert von AP2M1, ist eine Untereinheit aus dem Adapter 2, einem zentralen Regulator der clathrinabhängigen Endozytose. In der Tat verringerte der siRNA Knockdown von AP2M1 oder die chemische Hemmung der clathrinabhängigen Endozytose den Eintritt von H-1PV in die Zellen stark. Anhand von Elektronenmikroskopie und konfokaler Mikroskopie wurden H-1PV-Partikel in Clathrin-beschichteten Membranvertiefungen und Vesikeln nachgewiesen, wodurch weiter bestätigt wurde, dass H-1PV die clathrinabhängige Endozytose für den Zelleintritt verwendet. Im Gegensatz dazu beobachtete ich keine Hinweise auf einen Viruseintritt durch Caveolae-vermittelte Endozytose. Außerdem zeige ich, dass die Internalisierung von H-1PV von der Aktivität von Dynamin abhängt und dass der Virustransport von den frühen bis zu den späten Endosomen stattfindet, wobei für eine erfolgreiche Infektion ein niedriger endosomaler pH-Wert erforderlich ist. Basierend auf den hier gesammelten Beweisen schlage ich ein Modell vor, bei dem H-1PV an die Sialinsäure der γ1-Ketten von Lamininen bindet und Galectin-1 die effiziente Internalisierung von Viruspartikeln durch clathrinabhängige Endozytose fördert. Zum ersten Mal beschreibt diese Dissertation die Zelleintrittswege von onkolytischem H-1PV.