German Title: Analyse von Kopienzahl-Variationsprofilen in Hirntumoren im Zusammenhang mit einem methylierungsbasierten Klassifikator

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Abstract

Brain tumour’s range from benign neoplasm such as pilocytic astrocytoma to malignant ones e.g glioblastoma. Histopathological diagnosis of these entities is frequently challenged with inter-observer variability. Moreover, the used genome wide methylation patterns cannot grade tumour severity which is key in patient management. Although specific copy number variation (CNV) profiles such as 1p/19q co-deletions is known to characterise oligodendroglioma and joint gain of chr 7 and loss of chr 10 characterise glioblastoma, other CNV profiles have not been well integrated in brain tumour diagnosis. Therefore, it seems promising to achieve improvements in methylation-based diagnostics and disease prognosis by establishing an approach to systematically include CNV information in classification of brain tumours. With the aim of addressing this issue, in the first phase of my study, I evaluated whether methylation data (450K and 850K epic) could inform about the presence of CNVs. I used 61 paired data sets processed from microarray based comparative genomic hybridization (aCGH) and Epic 450K/850K methylation arrays respectively. Copy number plots of the methylation data set were generated from the “conumee” R-package while aCGH data set plots were inferred from the “DNA copy” package. I observed >80% percent agreement between the two methods. To rule out chance agreement and check the extent agreement, I calculated Kappa statistics. I observed moderate (0.54) to substantial (0.61) Kappa statistic values. In conclusion I provided evidence that the methylation data is reliable in determining CNVs.

In the second phase, I evaluated the CNV profiles and survival times using Kaplan Meier analysis between WHO classified astrocytoma grade II and III data (n=117) obtained from the cancer genome atlas (TCGA). Before clustering, I observed no significant difference in survival in WHO grade II and III. After hierarchical clustering (Pearson coefficient correlation ward linkage) using the log2 CNV values, I was able to identify 7 clusters which had different survival rates. The clusters had both unique and shared alteration between them. For example, cluster 4 (n=10) showed better survival with deletions at Chr3q, 4q, 5p/q, 11p, 12q, 13q and gain in Chr12p. These regions carry genes such as ANO2, CD4, LRRC23, VWF and GALNT8 genes. Cluster 3 had poor survival and increased deletions at chr 1q, 2q, 3q, 4q, 5p/q, 6q, 7q, 11p, 13q and chr gain at 9p (n=54). Some key genes altered in these loci, included C2orf88, CDKN2A/B, RB1, SORBS2, POLD1, MYBPC2 and TP63. These genes play critical roles in cell cycle regulation, growth and tumour suppressions. Cluster 7 had losses at chr 4p/q, 13p/q and 19q (n=8) which contained genes like LRBA, FBXW7, MARCHF1, SPOCK3, MTUS2 and RFC3. Moreover, CDH12 gene and Long noncoding RNA (LINC005) regulating CCND2 at 5p and 13q respectively were also deleted in >75% of samples. I further noticed that glioblastoma recurrent cases and primary tumor could be differentiated by presence of chr7p/q gain, 9p, 10p/q and 13p/q deletions using a total of n= 1500 cases and n= 1400 controls data set retrieved from TCGA. The 9p and 10p/q loci are already known to encode cell survival and apoptotic genes such as CDK2A/B, MDM2, EGFR and PTEN which are common in high grade glioma. These results therefore promise better tumour diagnosis and patients stratification approach which would help in both patient management and treatment outcomes predictions by use of CNV profiles.

In the third phase of my study, I evaluated the methylation classes and pathways associated with genes in the altered regions. I observed a different frequency in the distribution of Isocitrate dehydrogenase (IDH) mutation and the 06- methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) in the 7 clusters. In specific clusters 1 and 6 were A_IDH 100% and 70% respectively. A_IDH_HG dominated the other clusters as follows: cluster 5 (50%), cluster 4 (33%), cluster 3 (13%) and cluster 7 (12%). This indicates that methylome classes can be aligned with the CNV profiles. Using ingenuity pathway-based knowledge, I was able to identify canonical pathways associated with altered genes per group. I observed that fairly unique signaling pathways were associated with the disease. Notably, PTEN, ERK/MAPK, P53, IL-3, Glioblastoma multiforme, glioma invasiveness and axonal guidance signaling which are associated with glioma formation are featured in most clusters. Key altered genes included adenomatous polyposis coli which is a tumor suppressor, Glycogen synthase kinase 3 beta (GSK-3β) which affects cell proliferation, retinoblastoma (Rb,) which codes a tumor suppressor rb protein while Platelet-derived growth factor (PDGF) and Phosphoinositide 3-kinases (P13K) both regulate cell growth and other cellular functions. Proto-oncogen Rat sarcoma (Ras), WNT, Son of Sevenless (SOS), Auditory processing deficit (APD) and beta catenin (CTNNB1) were also lost. The WNT pathway activation aids in cellular differentiation which promotes brain tumour formation while Ras /PI3K/RTK pathway contributes to tumour growth deregulation. These findings show that multiple pathways dysregulated by CNVs can help in establishing novel brain tumour stratification, diagnostics and consequently identification of novel drug targets.

Translation of abstract (German)

Hirntumore reichen von gutartigen Neubildungen wie dem pilozytischen Astrozytom bis hin zu bösartigen Neubildungen wie dem Glioblastom. Die histopathologische Diagnose dieser Entitäten wird häufig durch die Variabilität zwischen den Beobachtern erschwert. Darüber hinaus können die verwendeten genomweiten Methylierungsmuster nicht den Schweregrad des Tumors einstufen, der für das Patientenmanagement entscheidend ist. Obwohl spezifische Kopienzahlvariationen (CNV), wie z.B. 1p/19q Co-Deletionen, bekannt sind, um das Oligodendrogliom zu charakterisieren, und der gemeinsame Gewinn von chr 7 und der Verlust von chr 10 das Glioblastom kennzeichnen, sind andere CNV-Profile nicht gut in die Hirntumordiagnose integriert worden. Daher scheint es vielversprechend, Verbesserungen in der methylierungsbasierten Diagnostik und Krankheitsprognose zu erreichen, indem ein Ansatz zur systematischen Einbeziehung von CNV-Informationen in die Klassifikation von Hirntumoren etabliert wird. Auf dieses Ziel habe ich hingearbeitet. In der ersten Phase meiner Studie evaluierte ich, ob Methylierungsdaten (450K und 850K epic) über das Vorhandensein von CNV informieren können. Ich verwendete 61 gepaarte Datensätze, die aus der Mikroarray-basierten vergleichenden genomischen Hybridisierung (aCGH) bzw. dem Epic 450K/850K Methylierungsarray verarbeitet wurden. Die Kopienzahlplots der Methylierungsdatensätze wurden aus dem "conumee" R-Paket in bioconductor mit kleinen Modifikationen generiert. Für den aCGH-Datensatz wurden CNV-Plots aus dem "DNA copy"-Paket abgeleitet. Ich beobachtete >80% prozentuale Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden. Um eine zufällige Übereinstimmung auszuschließen und das Ausmaß der Übereinstimmung zu überprüfen, habe ich die Kappa-Statistik berechnet. Ich beobachtete mäßige (0,54) bis erhebliche (0,61) Kappa-Statistikwerte. Zusammenfassend habe ich den Nachweis erbracht, dass die Methylierungsdaten bei der Bestimmung von CNV zuverlässig sind.

In der zweiten Phase bewertete ich die CNV-Profile und Überlebenszeiten mittels Kaplan-Meier-Analyse zwischen den WHO-klassifizierten Astrozytomen Grad II und III der Krebsgenom-Atlas (TCGA)-Daten (n=117). Vor dem Clustering beobachtete ich keinen signifikanten Unterschied im Überleben zwischen WHO-Grad II und III. Nach dem hierarchischen Clustering (Pearson coefficient correlation ward linkage) unter Verwendung der log2 CNV-Werte konnte ich 7 Cluster/Untergruppen identifizieren, die ein unterschiedliches Überleben hatten. Die Cluster hatten sowohl einzigartige als auch gemeinsame Veränderungen zwischen ihnen. Zum Beispiel zeigte Cluster 4 (n=10) ein besseres Überleben mit Deletionen an 3q,4q,5p/q,11p,12q,13q und Gain in chr 12p. Diese Regionen tragen Gene wie ANO2, CD4, LRRC23, VWF und GALNT8 Gene. Cluster 3 hatte ein schlechtes Überleben und erhöhte Deletionen in chr 1q,2q,3q,4q,5p/q,6q,7q,11p,13q und Gain in chr 9p (n=54). Einige Schlüsselgene, die an diesen Loci verändert waren, waren C2orf88, CDKN2A/B, RB1, SORBS2, POLD1, MYBPC2 und TP63. Diese Gene spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellzyklusregulation, dem Wachstum und der Tumorsuppression. Cluster 7 hatte Verlust an chr 4p/q, 13p/q und 19q (n=8), die Gene wie LRBA, FBXW7, MARCHF1, SPOCK3, MTUS2 und RFC3 enthielten. Darüber hinaus waren auch das CDH12-Gen und die lange nicht-kodierende RNA (LINC005), die CCND2 auf 5p bzw. 13q reguliert, in >75% der Proben deletiert. Des Weiteren konnte ich feststellen, dass Glioblastom-Rezidivfälle und Primärtumor durch das Vorhandensein von chr7p/q gain, 9p, 10p/q und 13p/q-Deletionen unterschieden werden konnten, wobei ich insgesamt n= 1500 Fälle und n= 1400 Kontrollen aus dem TCGA-Datensatz verwendete. Die 9p- und 10p/q-Loci sind bereits dafür bekannt, dass sie für Zellüberlebens- und apoptotische Gene wie CDK2A/B, MDM2, EGFR und PTEN kodieren, die bei hochgradigen Gliomen häufig vorkommen. Diese Ergebnisse versprechen daher eine bessere Tumordiagnose und einen Ansatz zur Patientenstratifizierung, der sowohl beim Patientenmanagement als auch bei der Vorhersage von Behandlungsergebnissen durch die Verwendung von CNV-Profilen helfen würde.

In der dritten Phase meiner Studie untersuchte ich die Methylierungsklassen und -pfade, die mit Genen in den veränderten Regionen assoziiert sind. Ich beobachtete eine unterschiedliche Häufigkeit in der Verteilung der Isocitrat-Dehydrogenase (IDH)-Mutation und der 06-Methyl-Guanin-DNA-Methyl-Transferase (MGMT) in den 7 Untergruppen. In den spezifischen Clustern 1 und 6 waren A_IDH 100% bzw. 70%. In den anderen Clustern dominierte A_IDH_HG wie folgt: Cluster 5 (50%), Cluster 4 (33%), Cluster 3 (13%) und Cluster 7 (12%). Dies zeigt, dass Methylom-Klassen mit den CNV-Profilen abgeglichen werden können. Mit Hilfe von ingenuity pathway-based knowledge konnte ich kanonische Signalwege identifizieren, die mit veränderten Genen pro Gruppe assoziiert sind. Ich beobachtete, dass ziemlich einzigartige Signalwege mit der Krankheit assoziiert waren. Insbesondere PTEN, ERK/MAPK, P53, IL-3, Glioblastoma multiforme, Gliom-Invasivität und Axonal Guidance Signaling, die mit der Gliombildung assoziiert sind, traten in den meisten Gruppen auf. Zu den wichtigsten veränderten Genen gehörten die adenomatöse Polyposis coli, die ein Tumorsuppressor ist, die Glykogensynthasekinase 3 beta (GSK-3β), die die Zellproliferation beeinflusst, das Retinoblastom (Rb,), das ein Tumorsuppressor-Rb-Protein kodiert, während der Platelet-derived growth factor (PDGF) und die Phosphoinositid-3-Kinasen (P13K) beide das Zellwachstum und andere zelluläre Funktionen regulieren. Proto-Onkogen Ratten-Sarkom (Ras), WNT, Son of Sevenless (SOS), Auditory processing deficit und beta-Catenin wurden ebenfalls verloren. Die Aktivierung des WNT-Signalwegs hilft bei der zellulären Differenzierung, die die Bildung von Hirntumoren fördert, während der Ras /PI3K/RTK-Signalweg zur Deregulation des Tumorwachstums beiträgt. Diese Ergebnisse zeigen, dass mehrere durch CNV dysregulierte Signalwege bei der Etablierung einer neuartigen Stratifizierung von Hirntumoren, bei der Diagnostik und folglich bei der Identifizierung neuer medikamentöser Angriffspunkte helfen können.