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PDF, English - main document Download (12MB) | Lizenz: Glyco-engineered HEK 293-F cell lines to produce therapeutic glycoproteins with human N-glycosylation and improved pharmacokinetics by Uhler, Rico underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

Abstract

Using human cell lines for the production of therapeutic proteins can be beneficial due to their ability to generate fully human post-translational modifications. HEK 293 cells are an efficient expression system with a record of approved therapeutic protein products. However, the presence of N-acetylgalactosamine, the low sialylation on N-glycans of recombinant HEK 293 cell-derived glycoproteins and the resulting efficient clearance via glycan receptors in patients—namely the asialoglycoprotein receptor and the mannose receptor—currently limits its use in therapeutic protein production. To be able to produce recombinant proteins without N-acetylgalactosamine on their N-glycans, HEK 293-F clones featuring a functional KO of both the B4GALNT3 and B4GALNT4 genes were generated. Subsequently, to increase the sialylation, sialyltransferases ST6GAL1 and ST3GAL6 were overexpressed by gene knock-in. The model protein factor VII-albumin was expressed in these new host cell lines to evaluate the phenotypic changes induced by the described glyco-engineering. Furthermore, medium supplementation with N-acetylmannosamine and cytidine was tested to improve sialylation. HEK 293-F cells with B4GALNT3 and B4GALNT4 knock-out produced factor VII-albumin devoid of N-acetylgalactosamine and sulfated N-acetylgalactosamine, with reduced antenna fucosylation and increased antennarity, bisecting N-acetylglucosamine as well as sialylation. Overexpression of ST6GAL1 or ST3GAL6 further increased sialylation and reduced antenna fucosylation, while sialylation was not affected by medium supplementation of sialic acid metabolism precursors N-acetylmannosamine and cytidine. Factor VII-albumin produced in the double N-acetylgalactosamine transferase knock-out cell line with simultaneous ST6GAL1 knock-in showed a level of sialylation similar to that of plasma-derived factor VII and higher than that of factor VII from CHO or BHK cells. As a result, asialoglycoprotein and mannose receptor binding of glyco-engineered factor VII-albumin variants was abolished in vitro and pharmacokinetic properties were improved in vivo. To determine whether the detected changes in N-glycosylation were specific for factor VII-albumin or whether the results are applicable to other proteins, B domain-deleted factor VIII and factor IX were expressed in the wild-type HEK 293-F cell line, the double N-acetylgalactosamine transferase knockout clone and the double N-acetylgalactosamine transferase knock-out clone with ST6GAL1 knock-in. Despite considerable differences in the N-glycosylation profiles of the three proteins, the effects of the applied glyco-engineering were largely comparable. Thus, these new glyco-engineered cell lines are suitable for the expression of fully human therapeutic proteins with favorable N-glycosylation and improved pharmacokinetic properties.

Translation of abstract (German)

die Produktion von therapeutischen Proteinen mit humanen posttranslationalen Modifikationen stellen humane Zelllinien ein vorteilhaftes System dar. HEK 293-F Zellen sind ein effizientes Expressionssystem, das schon von regulatorischen Behörden zur Produktion von therapeutischen Proteinen zugelassen wurde. Allerdings sind N-Glykane von Proteinen, die in HEK 293 Zellen produziert werden, besetzt mit N-Acetylgalactosamin und tragen wenige Sialinsäuren, was in Patienten zum schnellen Abbau der Proteine durch Glykanrezeptoren wie dem Asialoglykoproteinrezeptor oder dem Mannose Rezeptor führt. Dadurch ist die Produktion von therapeutischen Proteinen in HEK 293 Zellen auf solche beschränkt, die diese Glykanstrukturen nicht tragen. Um Proteine ohne N-Acetylgalactosamin produzieren zu können, wurden HEK 293-F Zellen, in denen die Enzyme B4GALNT3 und B4GALNT genetisch deaktiviert wurden, hergestellt. Um die Sialylierung zu erhöhen, wurden anschließend die Sialyltransferasen ST6GAL1 und ST3GAL6 durch eine Geninsertion überexprimiert. In den entstandenen Zelllinien wurde das Modellprotein Faktor VII-Albumin exprimiert und es wurden die phänotypischen Veränderungen analysiert, welche durch die angewandte Glyko-Optimierung induziert wurden. HEK 293-F Zellen ohne funktionelles B4GALNT3 und B4GALNT4 stellten Faktor VII-Albumin ohne N-Acetylgalaktosamin und sulfatiertem N-Acetylgalaktosamin, mit reduzierter Antennenfukosylierung und mit erhöhter Antennarität, bisecting N-Acetylglukosamin und Sialylierung her. Die Überexpression von ST6GAL1 oder ST3GAL6 führte zu einer weiteren Erhöhung der Sialylierung und Reduzierung der Antennenfukosylierung. Dagegen hatte die Zugabe von N-Acetylmannosamin und Cytidin, Vorläufer des Sialinsäuremetabolismus, zum Kulturmedium keinen Effekt auf die Sialylierung. Faktor VII-Albumin, das in der Zelllinie ohne B4GALNT3- und B4GALNT4-Aktivität aber mit ST6GAL1-Überexpression hergestellt wurde, zeigte eine ähnlich hohe Sialylierung wie Faktor VII aus humanem Plasma und eine höhere als FVII aus CHO oder BHK Zellen. Glyko-optimierte Faktor VII-Albumin-Varianten zeigten eine reduzierte Bindung an den Asialoglykoproteinrezeptor und den Mannose Rezeptor in vitro und verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften in vivo. Um festzustellen ob die detektierten Änderungen der N-Glykosylierung spezifisch für Faktor VII-Albumin sind, oder ob die Ergebnisse auch auf andere Protein übertragbar sind, wurde ein Faktor VIII Molekül ohne B-Domäne und ein Faktor IX Molekül in Wildtyp HEK 293-F Zellen hergestellt, sowie in HEK 293-F Zellen ohne funktionelles B4GALNT3 und B4GALNT4 und in HEK 293-F Zellen ohne funktionelles B4GALNT3 und B4GALNT4 aber mit überexprimiertem ST6GAL1. Obwohl sich die N-Glykosylierung der drei Proteine grundlegend unterscheidet, waren die Veränderungen durch die angewendete Glyko-Optimierung in allen drei vergleichbar. Die neuen, glyko-optimierten Zelllinien sind daher für die Herstellung von vollständig humanen Proteinen mit vorteilhafter N-Glykosylierung und verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften geeignet.