German Title: Entschlüsselung der molekularen Regulation der antiviralen Deaminase APOBEC3B

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Abstract

Although effective vaccines against the hepatitis B virus (HBV) are available, it remains a major global health burden. The World Health Organisation estimates that nearly 300 million people are infected with HBV as of 2019 and chronic carriers, suffering from chronic hepatitis B (CHB) are at high risk of developing end-stage liver disease, such as liver cirrhosis and liver cancer. HBV has a complicated life cycle with 2 main steps: (I) the establishment of the viral genome - the covalently closed circular DNA (cccDNA) - in the nucleus of infected hepatocytes, which is highly stable and used as the template for all viral RNAs, and (II) a reverse transcription step, which produces a replicative intermediate - the relaxed circular DNA (rcDNA) - from the pre-genomic RNA (pgRNA). In the clinic, CHB patients are often treated with nucleotide and nucleoside analogues (NAs), which efficiently block the reverse transcription and prevent spread of the virus. While these treatments can prevent the progression of the liver disease, they cannot cure the infection. Therefore, the development of resistance against NAs or being non-compliant to the treatment can result in a relapse of the infection. The research group of Prof. Mathias Heikenwälder and colleagues were the first to show that the agonisation of the lymphotoxin beta receptor (LTβR) on the surface of hepatocytes with an antibody (named BS1) leads to the degradation of the cccDNA. Importantly, they presented evidence that the infection did not rebound after withdrawal of the LTβR agonist, which is the case for the treatment with NAs. The degradation of the cccDNA was dependent of the induction of the apolipoproteins B mRNA editing catalytic polypeptide-like 3B (APOBEC3B), an antiviral enzyme with cytidine deaminase activity, which efficiently edited cytosines to uracils within the cccDNA, eventually leading to the degradation of the cccDNA. These findings represented a potential novel treatment option for CHB patients, allowing for a cure of the disease by directly targeting the viral genome and degrading it, therefore preventing viral rebound.

Aim 1: Deciphering transcriptional and post-transcriptional control of APOBEC3B In this scientific context, I investigated key factors involved in the regulation of APOBEC3B on the transcriptional and post-transcriptional level. I used HBV infected and non-infected differentiated HepaRG (dHepaRG), treated or not with the LTβR agonist BS1. Further, CRISPR-Cas9-induced knock-out cell lines of dHepaRG, small interfering RNA, and micro RNA (miRNA) transfections into dHepaRG as well as kinase inhibitors were used to shed light on key molecular mechanisms involved in APOBEC3B regulation. The data of this PhD thesis indicate that APOBEC3B induction is mediated by the nuclear factor kappa B (NF-κB), and that mainly the non-canonical NF-κB signalling, through RelB/p52 dimers, plays an important role in APOBEC3B induction. Furthermore, the miRNA hsa-miR-138-5p is a post-transcriptional repressor of APOBEC3B. Interference with NF-κB signalling and aberrant expression of hsa-miR-138-5p reduced inducibility of APOBEC3B by LTβR activation and prevented strong anti-cccDNA effects of the treatment. I published these results as a co-first author in Journal of Hepatology Reports in August 2021 (DOI: 10.1016/j.jhepr.2021.100354).

Aim 2: Hypoxia reduces antiviral effects of LTβR activation and offers a niche for HBV to avoid immune responses Next, I deciphered how oxygen levels, sensed on a cellular level inter alia by hypoxia induced factor 1 alpha (HIF1α), affect APOBEC3B expression and anti-cccDNA effects of LTβR activation. To this end, I also used HBV infected and non-infected dHepaRG, treated or not with the LTβR agonist BS1. Transgenic dHepaRG cell lines, transfection of siRNAs, and pharmacological inhibition of proline hydroxylases (i.e. proteins involved in the destabilisation of HIF1α) were also used. In addition, I analysed histological stainings of liver sections of CHB patients. I identified HIF1α as a restriction factor for APOBEC3B induction by LTβR activation. RelB protein levels were reduced under high HIF1α protein levels, preventing efficient APOBEC3B induction and subsequent anti-cccDNA effects. My data indicated that liver areas presenting high levels of HIF1α can offer a reservoir for HBV in vivo, in which the virus can avoid immune-mediated clearance. I published these results as a co-first author in Hepatology in April 2021 (DOI: 10.1002/hep.31902).

Translation of abstract (German)

Obwohl effektive Vakzine verfügbar gegen das Hepatitis B Virus (HBV) verfügbar sind, bleibt dieses Virus ein ernstzunehmendes, globales Gesundheitsproblem. Die Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation, WHO), schätzt, dass im Jahr 2019 knapp 300 Millionen Personen mit HBV infiziert waren. Patienten, die an einer chronische Hepatitis B (CHB) leiden, weisen ein hohes Risiko auf, eine fatale Leberpathologie auszubilden, zum Beispiel eine Leberzirrhose oder Leberkrebs. HBV hat einen komplizierten Lebenszyklus, den man grob in zwei wichtige Schritte einteilen kann: (I) Die Etablierung der zirkulären, kovalent geschlossenen DNA (cccDNA, engl. covalently closed circular DNA) im Zellkern infizierter Hepatozyten, die sehr stabil ist und als Vorlage aller viralen mRNAs dient, und (II) ein reverser Transkriptions-Schritt, der die relaxierte, zirkuläre DNA (rcDNA, engl. Relaxed circular DNA) auf Grundlage der prägenomischen RNA (pgRNA) produziert. Klinisch werden CHB Patienten oft mit Nukleotid- und Nukleosid-Analoga (NA) behandelt, die mit hoher Effizienz die reverse Transkription von HBV inhibieren und dadurch die Vermehrung des Virus unterbinden. Diese Behandlung kann dazu beitragen, das Fortschreiten der Lebererkrankung zu verlangsamen oder zu stoppen, jedoch kann die Krankheit nicht komplett geheilt werden und bei einer Ausbildung von Resistenzen gegen die Behandlung oder dem nicht-Einhalten der Medikamenteneinnahme kann dazu führen, dass die Krankheit wieder ausbricht. Die Arbeitsgruppe von Prof. Mathias Heikenwälder, zusammen mit Kollegen, war die erste, die zeigen konnte, dass die Agonisierung des Lymphotoxin beta Rezeptors (LTβR) mit einem Antikörper (genannt BS1) zu einer Degradierung der cccDNA führt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass auch nach Beendigung der Behandlung die Erkrankung nicht mehr ausbrach, wie es bei der Behandlung mit NA der Fall war. Die Degradierung der cccDNA war abhängig von der Induktion des antiviralen Proteins apolipoproteins B mRNA editing catalytic polypeptide-like 3B (APOBEC3B), welches eine Cytidin-Deaminase Aktivität aufweist. Dieses Protein deaminierte Cytosine in der cccDNA zu Uracilen, was schlussendlich die Degradierung der cccDNA zur Folge hatte. Diese Resultate könnten eine neue Behandlungsoption für CHB Patienten darstellen, die auch kurativ wirkt und nicht nur das Virus in der Ausbreitung hemmt, da die cccDNA direkt angegriffen und abgebaut wird was einen erneuten Ausbruch der verhindert.

Ziel 1: Entschlüsselung der transkriptionellen und post-transkriptionellen Expressionskontrolle von APOBEC3B In dem wissenschaftlichen Kontext dieser PhD Thesis untersuchte ich Schlüsselfaktoren, die die APOBEC3B Expression auf der transkriptionellen und post-transkriptionellen Ebene regulieren. Dafür verwendete ich HBV-infizierte und nicht-infizierte differenzierte HepaRG (dHepaRG) Zellen, die mit dem LTβR Agonisten BS1 behandelt wurden. Des Weiteren wurden CHRISPR-Cas9 induzierte Knock-Out dHepaRG verwendet; außerdem verwendete ich kurze, interferierende RNAs (siRNAs, engl. small interfering RNAs) und microRNAs (miRNAs), die in dHepaRG transfiziert wurden. Darüber hinaus wurden Kinase-Inhibitoren verwendet, um die molekularen Schlüsselmechanismen, die der APOBEC3B Regulierung zugrunde liegen, näher zu beleuchten. Die Daten in dieser PhD Thesis verdeutlichen, dass die APOBEC3B Induktion vom nukleären Faktor kappa B (NF-κB) Signaltransduktionsweg abhängt und dass vorrangig der nicht-kanonische NF-κB Signaltransduktionsweg über RelB/p52 Dimere eine wichtige Rolle spielt. Darüber hinaus ist die miRNA hsa-miR-138-5p ein post-transkriptioneller Repressor von APOBEC3B. Die Blockade von NF-κB und die aberrante Expression von hsa-miR-138-5p reduzierte die Induzierbarkeit von APOBEC3B durch LTβR Aktivierung und verhinderte starke anti-cccDNA Effekte der Behandlung. Ich konnte diese Ergebnisse als Ko-Erstautor in Journal of Hepatology Reports im August 2021 publizieren (DOI: 10.1016/j.jhepr.2021.100354).

Ziel 2: Hypoxie reduziert antivirale Effekte der LTβR Aktivierung und schafft eine Nische für HBV, in der Immunreaktionen vermieden werden können Als nächstes entschlüsselte ich, wie der Sauerstoffgehalt, der auf zellular Ebene unter anderem über den Hypoxia-induzierten Faktor 1 alpha (HIF1α) wahrgenommen wird, die APOBEC3B Expression und die anti-cccDNA Effekte der LTβR Aktivierung beeinflusst. Dazu verwendete ich ebenfalls HBV-infizierte und nicht-infizierte dHepaRG Zellen, die mit dem LTβR Agonisten BS1 behandelt wurden. Außerdem wurden transgene dHepaRG Linien verwendet, siRNA Transfektionen durchgeführt und dHepaRG mit Inhibitoren behandelt, die die Aktivität von Polin-Hydroxylasen blockieren, Proteine die in die Destabilisierung von HIF1α involviert sind. Ebenfalls habe ich histologische Färbungen von Lebern von CHB Patienten untersucht. Ich konnte HIF1α als Restriktionsfaktor für APOBEC3B Induktion durch LTβR Aktivierung identifizieren. RelB Protein Levels waren reduziert unter hohen HIF1α Proteinlevels, was eine effiziente APOBEC3B Induktion und anti-cccDNA Effekte verhinderte. Meine Daten weisen darauf hin, dass in Leberregionen mit hohen HIF1α Levels ein Reservoir für HBV darstellen können, in denen das Virus einem immun-vermittelten Abbau entgeht. Ich konnte diese Ergebnisse als Ko-Erstautor in Hepatology im April 2021 publizieren (DOI: 10.1002/hep.31902).