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Abstract

HER2 over-expressing breast cancer (HER2+ BC) is an aggressive breast cancer subtype that is responsible for approximately 20% of overall cases. Targeted therapies have been developed against the HER2 driver oncogene which has significantly improved patient outcomes. However, HER2+ BC still has comparatively high rates of relapses following first-line neoadjuvant or adjuvant therapy, compared to other breast cancer sub-types.

These relapses are characterised by a poor prognosis, and metastatic tumors (de novo origin or relapsed) are considered incurable. This presents a continued need to identify therapeutic drugs that can be administered alongside first-line HER2-targeted therapy to kill or prevent re-growth of residually surviving tumor cells in order to prevent subsequent relapses.

Pirin (encoded by PIR) is a comparatively under-characterised iron-binding protein that serves as a transcriptional regulator through interactions with NF-κβ. It has been suggested in the literature as a potentially attractive target for cancer therapy. Preliminary functional characterisation of a pirin ligand generated and characterised by the EMBL Chemical Biology Core Facility (CBCF), named EMBL-703625, suggested anti-tumor efficacy and excellent in vivo tolerability in mice. Transcriptomic data from HeLa cells treated with EMBL-703625 from the EMBL-CBCF have identified multiple de-regulated cellular processes as a result of pirin inhibition, such as glycolysis and the expression of heat shock proteins. Many of these same processes have also been identified as mechanisms of treatment evasion or relapse in HER2-targeted therapy resistant breast cancer cells.

This project characterised treatment with EMBL-703625 alongside lapatinib, which is a clinically licensed HER2 tyrosine kinase inhibitor. Using a combination of biochemical assays, synergy modelling and transcriptomic experiments, we demonstrated that this combination synergistically reduces cell viability and increases toxicity in 3D grown, human, HER2-overexpressing breast cancer cell lines: BT-474 and SK-BR3. This appears to be conferred through their largely unique effects on the cell transcriptome. Additionally, it appears that this drug combination could also prevent re-growth of BT-474 cells following treatment removal. Experiments on tumor-inducible primary mouse mammary cells suggest that their combinatorial effect applies uniquely to neoplastically transformed cells. As well as this, it is possible that lapatinib and EMBL-703625 confer their synergy, in part, through glycolytic inhibition. One drug given after another may also enhance tumor killing, which could allow patients to potentially avoid more severe side effects compared to simultaneous treatment.

Additionally, this project aimed to use light-sheet microscopy to characterize intercellular cell heterogeneity on a 3-dimensional spatial and temporal basis. This was performed through the light-sheet imaging of SK-BR3 cells transfected with a fluorescent sensor named SoNar, which reads out on the NAD+/NADH ratio of cells. Image analysis pipelines were established, with deconvolution of raw-light sheet images potentially allowing an understanding of cell-cell heterogeneity in the future.

Finally, as part of a parallel analysis with data generated in the Jechlinger Lab, an integrated metabolomic and transcriptomic analysis from experiments on tumor-inducible in vitro primary mouse mammary gland cells was performed. This highlighted potential cellular pathways and processes related to cell metabolism that could serve as nodes of vulnerability for residually surviving cells and/or tumor cells, which could inform on similar experimental strategies in the future.

Overall, these results provide pre-clinical data that could provide a rationale for the progression of combined HER2 and Pirin inhibition into a clinical setting, pending additional results from in vivo mouse experiments that are planned.

Translation of abstract (German)

HER2-positiver Brustkrebs (HER2+ BK) ist ein aggressiver Untertyp des Mammakarzinoms bei dem das HER2-Gen überexprimiert ist und der für ca. 20% der Gesamtfälle verantwortlich ist. Obwohl zielgerichtete Therapien gegen das HER2-Onkogen entwickelt wurden, wodurch sich die Behandlungsergebnisse für die Patientinnen deutlich verbessert haben, gibt es beim HER2+ BK immer noch relativ hohe Raten von Rückfällen nach einer neoadjuvanten oder adjuvanten Erstlinientherapie. Diese Rezidive sind von einer schlechten Prognose gekennzeichnet, und metastasierte Tumore (neu entstandene oder rezidivierte) gelten als unheilbar. Daher besteht weiterhin Bedarf an der Identifizierung von therapeutischen Medikamenten, die zusätzlich zur HER2-gerichteten Erstlinientherapie verabreicht werden können, um verbliebene überlebende Tumorzellen abzutöten oder deren erneutes Wachstum zu verhindern und damit weitere Rückfälle zu vermeiden.

Pirin (kodiert durch das Gen PIR) ist ein relativ unzureichend charakterisiertes eisenbindendes Protein, das durch Interaktionen mit NF-κβ als Transkriptionsregulator dient. Es wurde in der Literatur als potentiell attraktives Ziel für die Krebstherapie vorgeschlagen. Eine vorläufige funktionelle Charakterisierung eines Pirin-Liganden, der von der EMBL Chemical Biology Core Facility (CBCF) generiert und charakterisiert wurde und den Namen EMBL-703625 trägt, deutet auf eine anitumorale Wirksamkeit und eine sehr gute Verträglichkeit in Mäusen hin. Transkriptomische Daten von HeLa-Zellen, die mit EMBL703625 aus der EMBL-CBCF behandelt wurden, haben mehrere deregulierte zelluläre Prozesse als Folge der Pirin-Inhibition identifiziert, wie z.B. die Glykolyse und die Expression von Hitzeschockproteinen. Viele dieser Prozesse wurden auch als Mechanismen identifiziert, die in Brustkrebszellen, die resistent gegenüber einer auf HER2 abzielenden Therapie sind, für einen Rückfall oder eine Umgehung der Behandlung sorgen.

Mithilfe einer Kombination aus biochemischen Testverfahren, Synergiemodellierung und Analyse des Transkriptoms wurde in diesem Projekt festgestellt, dass Lapatinib, ein klinisch zugelassener HER2-Tyrosinkinase-Inhibitor, bei gleichzeitiger Verabreichung mit EMBL703625 die Zellviabilität synergistisch reduziert. Darüber hinaus sorgte das Zusammenwirken der beiden Wirkstoffe dafür, dass sich die Toxizität in zwei humanen HER2- überexprimierenden Brustkrebszelllinien (BT-474 und SK-BR3) erhöht, die in 3D-Zellkultur gezüchtet wurden. Diese Ergebnisse werden offenbar durch die größtenteils einzigartigen Effekte der beiden Medikamente auf das Transkriptom der Zellen bewirkt. Außerdem scheint es, dass diese Medikamentenkombination auch das erneute Wachstum von BT474-Zellen nach Ende der Behandlung verhindern kann. Experimente an tumorinduzierbaren primären Brustdrüsenzellen der Maus deuten darauf hin, dass die kombinatorische Wirkung ausschließlich auf neoplastisch transformierte Zellen entfaltet wird. Darüber hinaus ist es möglich, dass Lapatinib und EMBL-703625 ihre Synergie zum Teil durch die Inhibierung der Glykolyse vermitteln. Die sequenzielle Gabe der beiden Medikamente könnte die gleiche Wirkung wie die gleichzeitige Gabe haben, wodurch den Patientinnen schwere Nebenwirkungen erspart bleiben könnten.

Des Weiteren wurde in diesem Projekt die Lichtblattmikroskopie genutzt, um die Heterogenität zwischen verschiedenen Zellen auf 3-dimensionaler und zeitlicher Ebene zu charakterisieren. Dafür wurden SK-BR3-Zellen mit dem Fluoreszenzsensor SoNar, der das intrazelluläre NAD+/NADH-Verhältnis anzeigt, transfiziert und per lichtblattmikroskopie untersucht. Für die Bildanalyse der so gewonnenen Daten wurden Pipelines etabliert, wobei die Dekonvolution der Roh-Mikroskopiedaten in Zukunft zum Verständnis der Zellheterogenität beitragen könnte.

Parallel dazu wurden experimentelle Daten aus dem Jechlinger-Labor, die an tumorinduzierbaren primären Brustdrüsenzellen von Mäusen in Zellkultur gewonnen wurden, mit Hilfe einer integrierten metabolomischen und transkriptomischen Analyse ausgewertet. Dabei hat sich herausgestellt, dass es zelluläre Vorgänge und Prozesse des Zellstoffwechsels gibt, die potenziell verwundbare zentrale Knotenpunkte für verbleibende überlebende Zellen und/oder Tumorzellen darstellen könnten. Darauf basierend könnten in der Zukunft ähnliche experimentelle Strategien aufgebaut werden.

Insgesamt beinhaltet diese Arbeit präklinische Daten, die eine Grundlage für die Weiterentwicklung der kombinierten HER 2 und Pirin Inhibition in eine klinische Umgebung darstellen könnten, unter der Voraussetzung, dass weitere Ergebnisse aus in vivo Experimenten an Mäusen vorliegen.