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Abstract

Data generation is rapidly progressing and data interpretation is hardly keeping up. New tools and approaches are needed to assess, filter and decide upon the impact of variants on biological systems. This work first presents a novel method of interpreting variants found to be exclusively heterozygous in public datasets (1000 Genomes Project and gnomAD). Variant pathogenicity is scored by a benchmarked, Bayesian integration of a diversity of gene, protein, sequence and structural features. A new 3D clustering method was developed to identify and understand pathogenic variant mechanism. This method uses known functional knowledge from a protein of interest and is homologs, and intramolecular distances from known/predicted structures to group and map functional information. This puts candidate variants into context by according to previously known functions of residues within the same group. Experimental validation of putative pathogenic variants is important for understanding variant mechanism. Several variants of RHOA, a small GTPase relevant to many crucial signalling pathways, were subjected to a battery of laboratory experiments. Variants affecting sites involved in interactions with other proteins are known to typically cause a loss-of-function phenotypes in cancer. However, it became evident that variants showed unique mechanisms in terms of observed phenotypes. Overall it can be argued that there is no single mechanism related to RHOA dysregulation in cancer. Lastly, a new method was developed with the aim of assisting diagnostics via clinical genetics. The method is able to produce a biological triplicate of laboratory results within four to five weeks, which would be a clinically useful timeframe in which to act on decisions related to dysregulated proteins. Modified HEK cells are transfected with tetracycline-controlled plasmids, containing the wild-type and mutated genes of interest. After selection and tetracycline induction the cells are harvested and total cell RNA is used to study gene expression via microarrays. Gene expression patterns can then be used to assess whether a given protein mutation is changing the enzyme activity, which can additionally be tested by rapid follow-up experiments such as phosphoantibodies. This hope is that the results can then be used to adjust treatment regimens, for instance, by highlighting putative oncogenes.

Translation of abstract (German)

Die Generierung von Daten schreitet mit unglaublicher Geschwindigkeit voran, die Interpretation der Daten jedoch kann dabei kaum mithalten. Neue Werkzeuge und Herangehensweisen sind nötig um die Daten zu analysieren und zu filtern und zur Entdeckung neuer pathogener Mutationen. Diese Arbeit stellt eine neuartige Methode vor, um öffentliche Datensätzen (wie das 1000 Genom Projekt und gnomAD). Neu zu interpretieren. Die Bestimmung der Pathogenität einzelner Varianten fußt hierbei auf eine Sammlung verschiedener Datenpunkte (Gene & Protein Sequenz, Strukturelle Daten), welche über bayesianische Integration letztlich zu einer Bewertung führt. Diese Bewertung kann dann dabei helfen krankmachende Mutationen zu identifizieren, da eine höhere Bewertung indikativ ist für eine größere Wahrscheinlichkeit eine Krankheit auszulösen. Um neue krankmachende Mutationen nicht nur zu identifizieren sondern auch zu verstehen, wurde eine neue 3D Gruppierungsmethode entwickelt. Diese Methode nutzt bekanntes funktionelles Wissen über das Protein von Interesse (und homologer Proteine) zuzüglich intramolekularer Distanzen, um funktionelle Informationen zu gruppieren und auf die Proteinstruktur zu übertragen. Dies ist hilfreich um Kandidatenmutationen in einen funktionellen Kontext zu setzen, indem man sich auf bekannte Funktionen umliegender Positionen bezieht. Experimentelle Validierung von zuvor identifizierten pathogenen Varianten ist ein wichtiger Schritt moderner Wissenschaft. Mehrere Mutationen in RHOA, eine kleine GTPase relevant für viele wichtige Signalwege, wurden im Labor untersucht. RHOA Mutationen an Positionen die typischerweise Interaktionen zwischen RHOA und anderen Proteinen vermitteln sind bekannt dafür, dass diese einen Funktionsverlust-Phenotyp in Tumoren produzieren. Für die untersuchten Mutationen konnte jedoch gezeigt werden, dass diese auf verschiedene Weise einen Funktionsverlust auslösen, und dass nicht ein einzelner Signalweg zur Progression einer Krebserkrankung beiträgt. Darüber hinaus wurde eine Methode entwickelt um medizinische Forschung besser assistieren zu können. Diese neue Methode ist in der Lage ein biologisches Triplikat in vier bis fünf Wochen zu produzieren, was ein klinisch nützlicher Zeitrahmen darstellt. Zuerst werden modifizierte HEK Zellen mit Tetrazyklin-kontrollierbaren Plasmiden transfiziert, welche das Gen von Interesse beinhalten. Nach Selektion und Induktion mit Tetrazyklin werden die Zellen geerntet. Zelluläre RNA wird dann genutzt um die Genexpression mit Microarrays zu untersuchen. Genexpressionsmuster können anschließend genutzt werden um zu bestimmen ob bestimmte Mutationen die Aktivität des Proteins verändern, und welche mit Nachfolgeexperimenten weiter getestet werden könnte. Hoffentlich können diese Ergebnisse genutzt werden um Behandlungsmethoden zu verbessern, indem mögliche Onkogene aufgezeigt werden.