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Abstract

After circumventing the diffraction limit with super-resolution techniques like STED and PALM/STORM, MINFLUX nanoscopy combines the advantages of these techniques, pushing the optical resolution down to the label size. Thus, more than ever, fluorescence microscopy focuses on single fluorophores, exploiting different fluorescent and non-fluores-cent states. However, the behavior of the photoswitching between these states has not been investigated with respect to the MINFLUX performance. These fluorophore-specific properties heavily influence the image quality, particularly the localization efficiency in terms of success and speed. In this thesis, two dye classes with different excitation-decoupled switching mechanisms (reversible and irreversible) were evaluated for their potential for MINFLUX imaging. To this end, a versatile microscope setup was designed, enabling characterizations on single molecule level in confocal and wide-field illumination mode as well as PALM/STORM microscopy to identify the best dye candidates for MINFLUX imaging. Spontaneously blinking fluorophores (reversible switching) allowed for an up to 30-fold increase of localization speed as compared to previously reported blinking dyes. With photoactivatable dyes (irreversible switching), the localization success of MINFLUX nanoscopy was quantitatively benchmarked for the first time against PALM microscopy. Moreover, intra-marker distances were visualized, provoking a new perspective on labeling strategies for biostructural imaging.

Translation of abstract (German)

Nach der Überwindung der Beugungsgrenze mit superauflösenden Techniken wie STED und PALM/STORM kombiniert die MINFLUX Nanoskopie die Vorzüge dieser Techniken und verschiebt die optische Auflösung hin zur Markergröße. Daher konzentriert sich die Fluoreszenzmikroskopie mehr denn je auf einzelne Fluorophore, wobei verschiedene fluoreszierende und nicht-fluoreszierende Zustände ausgenutzt werden. Das Photoschalt-verhalten zwischen diesen Zuständen ist jedoch im Hinblick auf MINFLUX noch nicht analysiert worden. Diese fluorophorspezifischen Eigenschaften haben einen großen Einfluss auf die Bildqualität, insbesondere auf die Lokalisierungseffizienz in Bezug auf Erfolg und Geschwindigkeit. In dieser Arbeit wurden zwei Farbstoffklassen mit unterschiedlichen anregungsentkoppelten Schaltmechanismen (reversibel und irreversibel) auf ihr Potenzial für die MINFLUX Bildgebung untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein vielseitiger Mikro-skopieaufbau entworfen, der Charakterisierungen auf der Einzelmolekülebene im konfokalen und Weitfeld-Beleuchtungsmodus sowie PALM/STORM Mikroskopie ermöglicht, um die besten Farbstoffkandidaten für die MINFLUX Bildgebung zu identifizieren. Spontan blinkende Fluorophore (reversibles Schalten) erlaubten eine bis zu 30-fache Steigerung der Lokalisierungsgeschwindigkeit im Vergleich zu bereits publizierten blinkenden Farbstoffen. Mit photoaktivierbaren Farbstoffen (irreversibles Schalten) wurde der Lokalisierungserfolg der MINFLUX Nanoskopie zum ersten Mal quantitativ mit dem der PALM Mikroskopie verglichen. Darüber hinaus wurden Abstände innerhalb eines Markers bestimmt, was eine neue Perspektive auf die Markierungsstrategien für die Bildgebung biologischer Strukturen wirft.