German Title: 3D-4Pi MINFLUX Nanoskopie

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Abstract

Determining the position of fluorescent emitters in all three spatial dimensions and the temporal dimension is an essential tool in the life sciences because it allows dynamic processes in biological structures to be studied with high precision and minimal invasiveness. The rate of emitted photons usually limits the achievable spatio-temporal precision of such investigations. In this work, it is shown both theoretically and experimentally that in a MINFLUX setup with a 4Pi interferometer, this resource can be optimally leveraged by using coherently interfering counterpropagating beams. 3D isotropic precision is achieved by introducing tilts to these beams in the focal region. To enable 3D MINFLUX measurements, a phase scanner and a beam scanner have been developed and implemented in a 4Pi optics. The former allows for shifting an interferometrically generated local minimum of the excitation laser along the propagation axis of the laser beams. The latter allows positioning the laser beam in the pupil of the microscope objectives, tilting the measurement axis. Both scanners are based on crystal optics, so they can be controlled electro-optically with the highest spatial and temporal precision. With the MINFLUX microscope used here, measurements on single molecules are shown to have a 40 % higher photon efficiency than previous 3D MINFLUX measurements. In addition, sub-nm precision at short time scales on bright, photostable emitters at a measurement rate of approximately 9 kHz per axis is demonstrated. The high spatio-temporal precision of the system is used to gain new insights into the stepping behavior of DNA nanorobots and the 3D diffusion of single molecules and fluorescent beads. The results obtained demonstrate the superiority of a 3D-4Pi MINFLUX microscope in tracking single fluorescent emitters in three dimensions.

Translation of abstract (German)

Die Bestimmung der Position von fluoreszenten Emittern in allen drei räumlichen Dimensionen und der zeitlichen Dimension ist ein wichtiges Werkzeug in den Biowissenschaften, weil dadurch dynamische Prozesse in biologischen Strukturen höchst präzise und minimal invasiv untersucht werden können. Die zu erreichende räumlich-zeitliche Auflösung solcher Untersuchungen ist üblicherweise limitiert durch die Rate an emittierten Photonen. In dieser Arbeit wird sowohl theoretisch als auch im Experiment gezeigt, dass in einem MINFLUX-Setup mit einem 4Pi-Interferometer diese Ressource mittels kohärent interferierender gegenläufiger Strahlen bestmöglich genutzt werden kann. Isotrope 3D Präzision wird erreicht, indem die gegenläufigen Strahlen im Fokus verkippt werden. Um 3D MINFLUX Messungen zu ermöglichen, wurden ein Phasenscanner und ein Strahlscanner entwickelt und in einer 4Pi-Optik implementiert. Ersterer ermöglicht es ein interferometrisch erzeugtes lokales Minimum des Anregungslasers entlang der Propagationsachse der Laserstrahlen zu verschieben. Letzterer erlaubt die Positionierung des Laserstrahls in der Pupille der Mikroskopobjektive, wodurch die Messachse verkippt wird. Beide Scanner beruhen dabei auf Kristalloptik, so dass sie mit höchster räumlicher und zeitlicher Präzision elektrooptisch angesteuert werden können. Mit dem hier verwendeten MINFLUX-Mikroskop werden Messungen an Einzelmolekülen mit einer um 40 % höheren Photoneneffizienz als bei bisherigen 3D-MINFLUX Messungen gezeigt. Zudem wird an hellen, photostabilen Emittern sub-nm Präzision auf kurzen Zeitskalen bei einer Messrate von ca. 9 kHz pro Achse demonstriert. Die hohe räumlich-zeitliche Auflösung des Systems wird dazu verwendet, um neue Einsichten in das Schrittverhalten von DNA-Nanorobotern und die 3D Diffusion von Einzelmolekülen und fluoreszierenden Kügelchen zu erlangen. Die erzielten Ergebnisse zeigen die Überlegenheit eines 3D-4Pi-MINFLUX Mikroskops bei der Verfolgung von einzelnen fluoreszierenden Emittern in drei Dimensionen.