German Title: Physikochemische Reize zur Verbesserung der Qualität von künstlich gezüchtetem menschlichem Knorpel: die Rolle von Osmolarität und Kalzium

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Abstract

Due to the low regenerative capacity of articular cartilage, regenerative approaches are needed to treat cartilage defects and to restore the function of the tissue in the joint. However, a general drawback of current cartilage replacement tissues is an insufficient deposition of its main molecular components, type II collagen and proteoglycan. As a result, the tissue cannot withstand the demanding mechanical conditions in the joint. Recent studies of our group achieved an acute stimulation of cartilage matrix synthesis by a defined mechanical loading protocol which depended on the tissue’s glycosaminoglycan (GAG)-content and its associated fixed charge density (FCD). However, to what extend mechano-induced physicochemical sub-stimuli contribute to cartilage matrix production remains unclear. Identifying the decisive sub-parameter that contributes to load-induced stimulation of cartilage matrix synthesis would provide an easily applicable stimulus to optimize the quality of cartilage replacement tissues. Due to the essential role of osmotic pressure for cartilage function, hyperosmotic challenge appears as an important sub-parameter of the loading-response. However, the contribution of acute hyperosmotic pressure to cartilage homeostasis is unclear and models that take a cartilage typical FCD into consideration are required. Interestingly, long-term maturation of animal chondrocytes under hyperosmotic conditions enhanced the matrix content of engineered cartilage but this was so far never investigated for human 3D-cultured chondrocytes. Thus, the aim of this this study was to elucidate whether acute hyperosmotic stimulation, as a sub-parameter of mechanical compression, regulates cartilage matrix synthesis in a human engineered cartilage model at low and high FCD. In parallel, it was investigated whether long-term hyperosmotic stimulation can enhance the matrix synthesis and deposition of cartilage replacement tissue. To achieve these aims, human engineered cartilage was pre-matured for 3 or 35 days to develop a cartilage-like matrix of low or high FCD. Acute hyperosmotic stimulation on day 3 and on day 35 for 3 to 24 hours indicated that the known mechano-response markers ERK1/2, p38, NFAT5, FOS and FOSB are also immediate osmo-response markers, irrespective of the FCD content of the tissue. Opposite to previous results from mechanical loading studies, a downregulation of pro-chondrogenic SOX9 protein and BMP pathway activity indicated an anti-chondrogenic effect of short-term hyperosmotic stimulation on chondrocytes. However, this did not lead to changes in cartilage matrix synthesis at low and at high FCD. Thus, although acute hyperosmotic stimulation and mechanical compression partly triggered similar response pathways, short-term hyperosmotic pressure was no major player to influence the regulation of cartilage matrix synthesis. In the context of long-term hyperosmotic stimulation, previous studies suggested a role of the extracellular calcium microenvironment for cartilage matrix synthesis and deposition. Since articular chondrocytes (AC) and mesenchymal stromal cells (MSC) are often used cell types for the design of cartilage replacement tissues, the response of both cell types to long-term hyperosmotic stimulation was investigated using extracellular calcium. Interestingly, the here obtained data revealed that long-term hyperosmotic calcium stimulation for 35 days compromised cartilage matrix formation in AC-based cartilage replacement tissue but promoted the cartilage matrix formation in neocartilage generated from MSC. Investigation of pro- and anti-chondrogenic signaling pathways after long-term calcium stimulation indicated a specific induction of catabolic S100A4 and PTHLH expression in AC. Stimulating AC with recombinant human PTHrP1-34 peptide partly reproduced the calcium-mediated reduction of cartilage matrix deposition, suggesting a role of PTHrP for impaired cartilage matrix formation. Importantly, the inverse regulation of GAG synthesis in AC and MSC-derived chondrocytes was calcium-specific and not caused by general hyperosmotic effects. Long-term extracellular calcium stimulation, therefore, provides a novel means to enhance the cartilage matrix content of MSC-based engineered cartilage whereas such conditions should be avoided during AC neocartilage formation. Overall, this study provides important information on the role of physicochemical stimuli for cartilage matrix formation in human engineered cartilage. It was demonstrated that acute hyperosmotic pressure was no effective stimulus to influence cartilage matrix synthesis, and further studies are now needed to determine the contribution other load-induced sub-parameter for GAG synthesis. Furthermore, this study indicated that long-term high extracellular calcium treatment provides a novel means to enhance the quality of MSC-based cartilage replacement tissue by stimulating GAG synthesis and GAG deposition. For the application in osteochondral tissue engineering approaches, this implies that MSC should be the first choice for cartilage matrix deposition in the vicinity of resorbable calcified bone replacement materials. However, studies are now needed to confirm the here observed effects of soluble extracellular calcium using resorbable bone replacement material as a potential calcium source.

Translation of abstract (German)

Aufgrund der geringen Regenerationsfähigkeit von Knorpelgewebe bedarf es regenerativer Ansätze um Knorpeldefekte zu behandeln und so die Funktion des Gewebes im Gelenk wiederherzustellen. Derzeit sind Knorpelersatzgewebe durch eine unzureichende Ablagerung von Typ II Kollagen und Proteoglykan, den Hauptbestandteilen des Gelenkknorpels, limitiert, wodurch das gezüchtete Gewebe den anspruchsvollen mechanischen Bedingungen im Gelenk auf Dauer nicht standhalten kann. In früheren Studien unserer Forschungsgruppe konnte die Knorpelmatrixsynthese mit Hilfe eines definierten mechanischen Belastungsprotokolls akut stimuliert werden, wobei die Induktion entscheidend vom Glykosaminoglykan (GAG)-Gehalt des Ersatzgewebes und der damit verbundenen Ladungsdichte (engl. fixed charge density, FCD) abhing. Bisher ist jedoch unklar, inwiefern belastungsinduzierte physikalisch-chemische Reize zu den beobachteten Effekten beitragen. Die Identifizierung des entscheidenden physikalisch-chemischen Subparameters der Belastungsantwort, der für die Induktion der Knorpelmatrixsynthese verantwortlich ist, würde es ermöglichen, Knorpelersatzgewebe mit einer einfach anwendbaren Stimulation gezielt zu verbessern. Aufgrund seiner Relevanz für die Funktion des Gelenkknorpels erscheint hyperosmotischer Druck als ein wesentlicher Subparameter der mechanischen Belastungsantwort. Da bisher allerdings unklar ist, inwiefern akuter hyperosmotischer Druck zur Knorpelhomöostase in reifem Knorpelersatzgewebe beiträgt, sind Studien notwendig, die dies unter Berücksichtigung einer knorpeltypischen FCD untersuchen. Interessanterweise wurde in Studien bereits gezeigt, dass eine langfristige hyperosmotische Stimulation den Knorpelmatrixgehalt in nicht-humanen Chondrozyten erhöht. Ob dies auch für humane Chondrozyten in 3D-Kultur der Fall ist wurde bisher jedoch nicht untersucht. Das Ziel dieser Studie war es daher herauszufinden, ob eine akute hyperosmotische Stimulation, als Subparameter der mechanischen Kompression, die Knorpelmatrixsynthese in humanem Knorpelersatzgewebe bei niedriger und hoher FCD beeinflusst. Parallel dazu wurde getestet, ob eine langfristige hyperosmotische Stimulation die Matrixsynthese und Ablagerung von Knorpelersatzgewebe verbessern kann. Um diese Ziele zu erreichen, wurde humanes Knorpelersatzgewebe für 3 oder 35 Tage vorgereift, um eine knorpelähnliche Matrix mit niedrigem oder hohem FCD-Gehalt zu generieren. Die akute hyperosmotische Stimulation von Knorpelersatzgewebe für 3 bis 24 Stunden ergab, dass die bekannten mechanosensitiven Marker, ERK1/2, p38, NFAT5, FOS und FOSB, FCD-unabhängig auch als osmosensitive Marker fungieren. Im Gegensatz zu früheren Belastungsstudien allerdings deuteten reduzierte SOX9-Proteinspiegel und eine verringerte BMP-Signalwegaktivität auf eine anti-chondrogene Wirkung der hyperosmotischen Stimulation auf Chondrozyten hin, wobei die Knorpelmatrixsynthese unverändert blieb. Somit konnte gezeigt werden, dass akute hyperosmotische Stimulation zwar einerseits ähnliche Signalwege induzierte wie mechanische Belastung, andererseits jedoch kein entscheidender Parameter für die Stimulation der Knorpelmatrixsynthese war. Für eine langfristige hyperosmotische Stimulation zur Verbesserung von Knorpelersatzgewebe erscheint extrazelluläres Kalzium aufgrund früherer Studien besonders vielversprechend. Da artikuläre Chondrozyten (AC) und mesenchymale Stromazellen (MSC) häufig verwendete Zelltypen für die Herstellung von Knorpelersatzgeweben sind, wurde in der vorliegenden Arbeit die Reaktion beider Zelltypen auf eine langfristige hyperosmotische Kalzium-Stimulation untersucht. Nach 35-tägiger Kalzium-Behandlung war die Knorpelmatrixbildung in AC-basiertem Knorpelersatzgewebe reduziert, in MSC-basiertem Knorpelersatzgewebe allerdings erhöht. Die Untersuchung wichtiger pro- und anti-chondrogener Signalwege nach langfristiger Kalziumstimulation zeigte eine spezifische Induktion der katabolen S100A4- und PTHLH-Genexpression in AC. Die Behandlung von AC mit rekombinantem humanem PTHrP1-34-Peptid konnte die kalziumabhängige Reduktion der Knorpelmatrixablagerung teilweise reproduzieren, was auf eine Rolle von PTHrP für die Beeinträchtigung der Knorpelmatrixbildung hindeutete. Bemerkenswert war außerdem, dass die inverse Regulation der Matrixsynthese in AC und MSC-basierten Chondrozyten kalziumspezifisch war und nicht durch allgemeine hyperosmotische Effekte verursacht wurde. Eine langfristige extrazelluläre Kalziumstimulation bietet daher einen vielversprechenden neuen Ansatz um den Knorpelmatrixgehalt in MSC-basiertem Knorpelersatzgewebe zu verbessern, wohingegen solche Bedingungen während der Knorpelbildung von AC kontraproduktiv sind. Insgesamt liefert diese Studie wichtige Erkenntnisse, um den Einfluss physikalisch-chemischer Reize auf die Knorpelmatrixbildung zu verstehen. Da nachgewiesen wurde, dass akuter hyperosmotischer Druck kein relevanter Parameter zur akuten Stimulation der Knorpelmatrixsynthese ist, sind nun weitere Studien erforderlich, um den Beitrag anderer belastungsinduzierter Subparameter zur Matrixsynthese zu untersuchen. Des Weiteren deckte diese Studie auf, dass eine langfristige Behandlung mit erhöhtem extrazellulärem Kalziumgehalt einen vielversprechenden neuen Ansatz liefert, um die Qualität von MSC-basiertem Knorpelersatzgewebe durch erhöhte Knorpelmatrixsynthese und -ablagerung zu verbessern. Für die Anwendung im osteochondralen Tissue Engineering würde dies bedeuten, dass MSC in Kombination mit resorbierbaren kalzifizierten Knochenersatzmaterialien die favorisierte Zellquelle für die Herstellung von Knorpelgewebe sein sollten. In weiteren Studien müssen die hier beobachteten Effekte von löslichem extrazellulärem Kalzium nun unter Verwendung resorbierbarer Knochenersatzmaterialien als potenzielle Kalziumquelle bestätigt werden.