German Title: Identifizierung und Validierung von Neoepitop-spezifischen T-Zell Rezeptoren für die Glioma Immunotherapie

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Abstract

Immunotherapy is a promising tool for cancer treatment and there is great interest to implement T cell-based therapies in patient care. Development of T cell-based therapies has focused on highly immunogenic tumors. Due to their low-mutational load and limited immune infiltration, gliomas are considered difficult targets for immune intervention and thus remained understudied, despite the urgent need to define new therapeutic options for these aggressive brain tumors. This thesis aimed at (I) identification and characterization of T cell responses elicited upon vaccination of glioma patients against the recurrent driver mutation R132H in isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), (II) identifying tumor-reactive T cell receptors (TCRs) targeting tumor-private antigens and (III) antigen-agnostic TCR identification in non-vaccinated patients with the overall aim to define a gene expression signature characteristic for tumor-reactive T cells. The IDH1R132H oncogenic driver mutation is found in about 70% of WHO grade 2 and 3 gliomas. Its homogenous exclusive expression in tumor tissue makes it an attractive target for immunotherapy, and vaccinations with an IDH1R132H encoding long peptide were shown to efficiently mediate tumor shrinkage in pre-clinical mouse models. The vaccine was proven to be immunogenic in primary WHO grade 3 and 4 IDH1-mutant astrocytomas in the completed NOA16 phase I clinical trial, and also shows immunogenicity in the ongoing NOA21 phase I clinical trial, where combination of the vaccine with the PD-L1 inhibitor avelumab is tested in patients with IDH1 mutant recurrent gliomas. To gain a deeper understanding of the T cell response following vaccination, I established “epitope specific expansion cultures” (ESPEC) with “subsequent identification of TCRs” (SUIT) to pre-select TCRs for testing their reactivity. Based on ESPEC, a total of 120 CD4-derived TCRs from seven patients were selected for cloning and functional validation in in vitro co-culture assays, of which 106 were shown to be reactive. IDH1R132H-reactive clones were found to be enriched intratumorally as compared to concurrently sampled blood of vaccinated patients. 49 identified IDH1R132H-reactive TCRs showed in vitro reactivity against wildtype IDH1 if the peptide was used at supraphysiological concentrations, but not at lower peptide concentrations as shown for a selection of TCRs. Analysis of HLA restrictions indicates promiscuous binding of the IDH1R132H peptide to HLA-DR alleles, which is in accordance with the high immunogenicity of the vaccine in an HLA-diverse patient population. Contrary to what was reported so far, I also observed CD8+ T cell responses against IDH1R132H in two of three tested patients. Mass spectrometry confirmed presentation of short IDH1R132H peptides on HLA-B*07:05 and HLA-B*35:01, with these HLA alleles being representative for 12.3% of the German population taking HLA supertype families into account. Using ESPEC-SUIT, one CD8-derived TCR reactive against IDH1R132H was identified. The TCR was found to infiltrate the tumor, making up 0.24% of the T cell repertoire and being positive for granulysin, which could be an indication of cytotoxic function. Extending the screening for reactive CD8-derived TCRs to further patients is planned to gain deeper insights into the vaccine-induced immune response. ESPEC-SUIT was also used to identify TCRs reactive to patient-individual antigens. Private neoepitopes, both from SNVs and fusion events, were predicted based on whole exome and RNA sequencing data of the tumor, and used to stimulate autologous PBMCs. ESPEC cultures were performed with individual peptides or in peptide pools to screen for reactive TCRs against 18-189 peptides per patient. For a colon carcinoma patient (POC-001), 25 of 28 screened TCRs were reactive, covering reactivities against 14 of 18 predicted neoantigens. For patient POC-004 with liposarcoma (12 mutations included for testing) and patient POC-005 with metastatic melanoma (50 mutations included for testing), several hundred expanded TCRs have been identified and await functional validation. While POC-001 and POC-004 were vaccinated with long peptides representative for a selection of mutanome encoded antigens prior to ESPEC, patient POC-005 did not receive such vaccination, but T cells were found to be expanded in post-ESPEC cultures for three short peptides and 32 long peptides, underlining the sensitivity of the ESPEC approach. To further understand the role of anti-tumor T cell immunity in brain tumors, tumor infiltrating lymphocytes (TILs) of non-vaccinated patients were used for single cell sequencing with the overall aim to identify a gene signature that can distinguish between tumor-reactive clones and non-reactive bystander clones for future antigen-agnostic identification of reactive TCRs. While gene signatures based on published markers identified no TCRs in primary brain tumors, a total of 46 reactive TCRs were identified when screening the top 83 TIL clonotypes from a melanoma brain metastasis tumor sample. On basis of this data, Chin Leng Tan (DKFZ Heidelberg, Germany) is working on establishing a gene signature, which could be used for antigen-agnostic discovery of reactive TCRs. Collectively, this thesis presents two strategies on how putatively tumor-reactive TCRs can be selected and validated on a larger scale. Screening for IDH1R132H-reactive TCRs allowed to gain deeper insights into the peripheral and intratumoral immune response elicited upon vaccination with the IDH1R132H peptide vaccine in brain tumor patients. The antigen-targeted approach was shown to be highly efficient for selecting reactive TCRs, which could potentially help to implement TCR-transgenic T cell therapies in patient care.

Translation of abstract (German)

Immuntherapien sind ein vielversprechendes Werkzeug zur Behandlung von Krebs und es gibt ein großes Interesse, T-Zell-basierte Therapien in der medizinischen Krankenversorgung zu implementieren. Die Entwicklung T-Zell-basierter Therapien hat sich bislang auf stark immunogene Tumore fokussiert. Aufgrund ihrer geringen Mutationslast und der limitierten Immuninfiltration werden Gliome als schwieriges Ziel für Immuninterventionen angesehen und wurden daher bislang von der Wissenschaft vernachlässigt, obwohl es einen dringenden Handlungsbedarf gibt, neue, therapeutische Optionen für diese aggressive Form Gehirntumore zu definieren. Diese Doktorarbeit zielt darauf ab, (I) T-Zell Antworten, die durch die Impfung von Gliompatienten gegen die wiederholt auftretende Verstärker-Mutation R132H in der Isocitrat Dehydrogenase 1 (IDH1) hervorgerufen wurden, zu identifizieren und charakterisieren, (II) Tumor-reaktive T-Zellrezeptoren (TZRs), die auf private Tumorantigene abzielen zu identifizieren und (III) Antigen-agnostisch TZRs in nicht geimpften Patienten zu identifizieren, um darüber für tumorreaktive T-Zellen charakteristische Genexpressionssignaturen zu definieren. Die onkogene IDH1R132H Verstärker-Mutation ist in etwa 70% der WHO-Grad 2 und 3 Gliome präsent. Aufgrund ihrer homogenen und exklusiven Expression in Tumorgewebe ist sie ein attraktives Ziel für Immuntherapien. Es wurde gezeigt, dass die Impfung mit einen für IDH1R132H kodierenden langen Peptid zu einer effizienten Reduktion von Tumormasse in präklinischen Mausmodellen geführt hat. Anhand der abgeschlossenen Phase 1 klinischen Studie NOA16 wurde die Immunogenität des Impfstoffes in primären WHO Grad 3 und 4 IDH1-mutierten Astrozytomen nachgewiesen. Der Impfstoff zeigt auch in der aktuell laufenden Phase 1 klinischen Studie NOA21 Immunogenität, wo dessen Kombination mit dem PD-L1 Inhibitor Avelumab in Patienten mit IDH1 mutierten rezidivierenden Gliomen getestet wird. Um ein besseres Verständnis der T-Zellantwort nach Impfungen zu erlangen habe ich „Epitop-spezifische Expansionskulturen“ (ESPEC) mit „anschließender Identifizierung von TZRs“ zur Vorauswahl von TZRs für anschließende Tests von deren Reaktivität etabliert. Basierend auf ESPEC wurden insgesamt 120 TZRs von CD4+ Klonen von sieben Patienten ausgewählt, von denen 106 nach der Klonierung und funktionellen Validierung in in vitro Ko-Kultur Versuchen Reaktivität aufwiesen. IDH1R132H-reaktive Klone wurden bei einem direkten Vergleich von zum gleichen Zeitpunkt entnommenem Blut und Tumorgewebe von geimpften Patienten mit einer Anreicherung im Tumor gefunden. 49 der identifizierten IDH1R132H-reaktiven TZRs waren in vitro gegen das IDH1 wildtyp Peptid reaktiv, wenn dieses in supraphysiologischen Konzentrationen eingesetzt wurde, aber nicht bei niedrigeren Peptidkonzentrationen, was anhand einer Auswahl an TZRs gezeigt wird. Analysen der HLA-Restriktion deuten an, dass das IDH1R132H Peptid promiskuitiv an HLA-DR Allele binden kann, was im Einklang zu Beobachtungen zur hohen Immunogenität des Impfstoffes in einer HLA-diversen Patientenpopulation steht. Entgegen vorheriger Berichte konnte ich auch eine CD8+ T-Zellantwort gegen IDH1R132H in zwei von drei getesteten Patienten beobachten. Massenspektrometrie hat die Präsentation von kurzen IDH1R132H Peptiden auf HLA-B*07:05 und HLA-B*35:01 bestätigt, wobei diese zwei HLA Allele unter Berücksichtigung von HLA-Supertypen repräsentativ für 12.3% der deutschen Bevölkerung sind. Mithilfe von ESPEC-SUIT wurde ein von CD8+ Zellen abstammender TZR mit Reaktivität gegen IDH1R132H gefunden. Der TZR infiltriert den Tumor, wo er 0.24% des T-Zellrepertoires ausmacht und positiv für den Marker Granulysin ist, was als Indiz für Zytotoxität gesehen werden kann. Das Ausweiten des Screens auf eine größere Patientenpopulation zur Identifikation weiterer TZRs von CD8+ Klonen ist geplant, um einen tieferen Einblick in die impfinduzierte Immunantwort zu erlangen. ESPEC-SUIT wurde auch verwendet, um gegen patientenindividuelle Antigene TZRs zu identifizieren. Aus Einzelnukleotid-Polymorphismen und Gen-Fusionen hervorgegangene private Neoepitope wurden anhand von Exom- und RNA-Sequenzierungen von Tumorgeweben vorhergesagt und verwendet, um damit autologe PBMCs zu stimulieren. ESPEC-Kulturen wurden entweder mit einzelnen Peptiden oder mit mehreren Peptiden auf einmal stimuliert, um reaktive TZRs gegen zwischen 18 bis 189 Peptide pro Patient zu screenen. Bei einem Patienten mit Kolonkarzinom (POC-001) waren 25 von 28 gescreenten TZRs reaktiv, was Reaktivitäten gegen 14 von 18 vorhergesagten Neoantigenen abdeckt. Bei Patient POC-004 (Liposarkom, 12 Mutationen wurden analysiert) und Patient POC-005 (metastasierendes Melanom, 50 Mutationen wurden analysiert) wurden mehrere hundert expandierte TZRs beobachtet, die nun auf ihre funktionelle Validierung warten. Während POC-001 und POC-004 mit langen Peptiden geimpft wurden, welche repräsentativ für einen Teil deren Mutanom-kodierten Antigene vor ESPEC sind, hat Patient POC-005 keine solche Impfung erhalten, wobei dennoch nach ESPEC expandierte T-Zellen in Kulturen mit drei kurzen Peptiden oder mit 32 langen Peptiden vorgefunden wurden, was die Sensitivität des ESPEC Ansatzes unterstreicht. Um die Rolle der anti-Tumor T-Zell Immunität in Hirntumoren besser zu verstehen, wurden außerdem Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs) von nicht-geimpften Patienten für Einzelzellsequenzierungen verwendet. Dabei war die allgemeine Zielsetzung die Identifizierung einer Gensignatur, die eine Unterscheidung zwischen Tumor-reaktiven und nicht-reaktiven Klonen erlaubt und somit in Zukunft ohne Kenntnis des Antigens die Identifizierung von reaktiven TZRs ermöglichen soll. Während mit einer Gensignatur, die auf Basis von publizierten Markers erstellt wurde, zunächst keine reaktiven TZRs in primären Hirntumoren gefunden wurden, wurden insgesamt 46 reaktive TZRs entdeckt, als die 83 intratumoral am stärksten expandierten TIL Klontypen einer Melanom-Hirnmetastase auf Reaktivität getestet wurden. Auf Basis dieser Daten wird von Chin Leng Tan (DKFZ Heidelberg, Deutschland) eine Genexpressionssignatur zur Vorhersage von reaktiven T-Zellen entwickelt. Zusammengefasst zeigt diese Doktorarbeit zwei Strategien auf, um Tumor-reaktive TZRs im großen Maßstab auszuwählen und zu validieren. Das Screening von IDH1R132H-reaktiven TZRs hat es ermöglicht tiefere Einblicke in die durch den IDH1R132H Peptidimpfstoff hervorgerufene periphere und intratumorale Immunantwort von Hirntumorpatienten zu erlangen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der auf ein spezielles Antigen ausgerichtete Ansatz eine hocheffiziente Methoden ist, um reaktive TZRs auszuwählen, was das Potential birgt, über diese Methode geeignete TZRs für zukünftigen TZR-transgenen T-Zell-Therapien auszuwählen.