Preview

PDF, English - main document Download (98MB) | Lizenz: Towards quantitative high-throughput 3D localization microscopy by Deschamps, Joran underlies the terms of Creative Commons Attribution 4.0

Abstract

Advances in light microscopy have allowed circumventing the diffraction barrier, once thought to be the ultimate resolution limit in optical microscopy, and given rise to various superresolution microscopy techniques. Among them, localization microscopy exploits the blinking of fluorescent molecules to precisely pinpoint the positions of many emitters individually, and subsequently reconstruct a superresolved image from these positions. While localization microscopy enables the study of cellular structures and protein complexes with unprecedented details, severe technical bottlenecks still reduce the scope of possible applications. In my PhD work, I developed several technical improvements at the level of the microscope to overcome limitations related to the photophysical behaviour of fluorescent molecules, slow acquisition rates and three-dimensional imaging. I built an illumination system that achieves uniform intensity across the field-of view using a multi-mode fiber and a commercial speckle-reducer. I showed that it provides uniform photophysics within the illuminated area and is far superior to the common illumination system. It is easy to build and to add to any microscope, and thus greatly facilitates quantitative approaches in localization microscopy. Furthermore, I developed a fully automated superresolution microscope using an open-source software framework. I developed advanced electronics and user friendly software solutions to enable the design and unsupervised acquisition of complex experimental series. Optimized for long-term stability, the automated microscope is able to image hundreds to thousands of regions over the course of days to weeks. First applied in a system-wide study of clathrin-mediated endocytosis in yeast, the automated microscope allowed the collection of a data set of a size and scope unprecedented in localization microscopy. Finally, I established a fundamentally new approach to obtain three-dimensional superresolution images. Supercritical angle localization microscopy (SALM) exploits the phenomenon of surface-generated fluorescence arising from fluorophores close to the coverslip. SALM has the theoretical prospect of an isotropic spatial resolution with simple instrumentation. Following a first proof-of-concept implementation, I re-engineered the microscope to include adaptive optics in order to reach the full potential of the method. Taken together, I established simple, yet powerful, solutions for three fundamental technical limitations in localization microscopy regarding illumination, throughput and resolution. All of them can be combined within the same instrument, and can dramatically improve every cutting-edge microscope. This will help to push the limit of the most challenging applications of localization microscopy, including system-wide imaging experiments and structural studies.

Translation of abstract (German)

Durch die Entwicklung neuer Techniken in der Lichtmikroskopie konnte das Brechungslimit überwunden werden, welches einst als ultimative Auflösungsgrenze der optischen Mikroskopie angesehen wurde. Als eine von diesen nutzt Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie das Blinken von Fluorophoren aus, um die Positionen vieler Emitter nacheinander zu bestimmen, und aus diesen ein hochauflösendes Bild zu rekonstruieren. Obwohl mittels Lokalisationsmikroskopie möglich ist, zelluläre Strukturen und Proteinkomplexe mit hoher Auflösung zu untersuchen, gibt es einige technische Hindernisse, die das derzeitige Anwendungsspektrum einschränken. In meiner PhD-Arbeit entwickelte ich mehrere technische Verbesserungen auf dem Level des Mikroskops, um Limitierungen bezüglich der Einzelmolekül-Photophysik, langsamer Aufnahmegeschwindigkeiten und drei-dimensionaler Bildgebung aufzulösen. Ich habe ein Beleuchtungssystem konstruiert, welches mittels einer Multimode-Faser und einem kommerziellen Speckle-Reduzierer eine gleichmäßige Beleuchtung im gesamten Sichtfeld erzeugt. Dadurch wird gleiches photophysikalisches Verhalten aller Fluorophore erreicht, was mit dem derzeit meistverbreiteten Beleuchtungssystem nicht realisierbar ist. Es lässt sich problemlos zu jedem Mikroskop hinzufügen, und erleichtert daher quantitative Experimente mittels Lokalisationsmikroskopie. Des Weiteren habe ich ein vollständig automatisiertes Lokalisations-Mikroskop entwickelt, welches auf einer Open-Source-Softwareumgebung basiert. Ich entwickelte hochspezialisierte Elektronik- und nutzerfreundliche Software-Lösungen, mittels derer komplexe Experimente geplant und durchgeführt werden können. Ich optimierte die Langzeitstabilität, wodurch die Aufnahme hunderter bis tausender Bilder über Tage und Wochen möglich wurde. In einer ersten Anwendung wurde Clathrin-vermittelte Endozytose in Hefe untersucht, und ein Datensatz aufgenommen, welcher in Größe und Umfang in der Lokalisationsmikroskopie beispiellos ist. Schließlich etablierte ich einen völlig neuen Ansatz für drei-dimensionale Lokalisationsmikrosopie. Superkritische-Winkel-Lokalisationsmikroskopie (SALM) basiert auf Oberflächen-generierter Fluoreszenz, welche von Fluorophoren nah am Deckglas emittiert wird. SALM kann mit einem einfachen Mikroskop theoretisch isotrope Auflösung erreichen. Nachdem ich das Konzept technisch demonstrierte, entwickelte ich das Mikroskop mittels Adaptiver Optiken weiter, um das volle Potential der Methode auszuschöpfen. Zusammengenommen habe ich einfache, aber wirkungsvolle, Lösungen für drei grundlegende technische Hindernisse in Lokalisationsmikroskopie etabliert, welche Beleuchtung, Durchsatz und Auflösung betreffen. All diese können kombiniert werden, und dadurch jedes moderne Mikroskop deutlich verbessern. Dadurch wird es immer besser möglich, auch höchst anspruchsvolle Anwendungen der Lokalisationsmikroskopie durchzuführen, wie beispielsweise systemweite Mikroskopie-Experimente, und strukturelle Studien.