German Title: Erforschung molekularer Mechanismen, die zu Tumor-Rebound-Wachstum nach MAPKi Behandlung in pLGG führen

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Abstract

Pediatric low-grade gliomas (pLGGs) are the most common primary brain tumors in children and are almost exclusively driven by alterations in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, most commonly BRAF fusions and BRAFV600E point mutations. This makes pLGGs a fitting candidate for targeted therapies using MAPK inhibitors (MAPKi), which have shown promising results in clinical trials. This led to the FDA-approval of dabrafenib and trametinib combination as front-line treatment for BRAFV600E driven pLGGs. However, despite the efficacy of MAPKi treatment, a subset of patients experiences a rapid tumor regrowth upon treatment stop, also referred to as rebound growth, which constitutes a significant clinical challenge.

To model rebound growth in vitro, based on viable cell counts in response to MAPKi treatment and withdrawal, four patient-derived pLGG models were tested. Following, a multi-omics dataset of the rebound model, encompassing different MAPKi withdrawal timepoints, was generated using RNA sequencing and LC-MS/MS-based phospho-/proteomics. Using this data set, I identified putative rebound growth driving mechanisms, which were further validated in vitro and in vivo.

Of the tested models, BT-40 (BRAFV600E, CDKN2A/Bdel) showed rebound growth, characterized by faster cell regrowth after MAPKi withdrawal compared to standard-of-care chemotherapy, thereby mimicking what is observed in patients. Using this model, I observed MAPK pathway reactivation within hours after withdrawal, associated with a transient overactivation of key MAPK molecules on transcriptional (e.g. FOS) and phosphorylation (e.g. pMEK) levels. Furthermore, AKT activity and expression and secretion of cytokines (in particular CCL2, CX3CL1, CXCL10 and CCL7) were increased upon MAPKi treatment and maintained during early withdrawal (until 6-24 h). While neither increased AKT activity nor cytokine expression affected rebound growth in a tumor cell intrinsic manner, upregulated cytokines mediated increased attraction of microglia cells during MAPKi treatment and withdrawal. Importantly, MAPK pathway reactivation during rebound growth and increased expression of CX3CL1 and CXCL10 upon MAPKi treatment were also observed in vivo using the BT-40 orthotopic xenograft model.

In summary, this study suggests rapid MAPK reactivation as a tumor cell intrinsic rebound driving mechanism and modulation of MAPK activity during treatment withdrawal may be a possible strategy to target rebound growth, which should be further investigated. Furthermore, I could show increased microglia attraction, mediated by cytokines induced upon MAPKi treatment, suggesting a possible role of the immune microenvironment, in particular microglia cells, during MAPKi treatment and withdrawal, which warrants further investigation.

Translation of abstract (German)

Pädiatrische niedriggradige Gliome (pLGG) sind die häufigsten pädiatrischen Hirntumore und werden hauptsächlich von Mutationen im „mitogen-actived potein kinase (MAPK)“-Signalweg, am häufigsten BRAF-Fusionen und BRAFV600E-Punktmutationen, angetrieben. Dadurch sind pLGGs ein geeigneter Kandidat für zielgerichtete Therapien mit MAPK-Inhibitoren (MAPKi), die in klinischen Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt haben. Dies führte zur FDA-Zulassung der Kombination aus Dabrafenib und Trametinib als Erstlinienbehandlung für pLGGs mit BRAFV600E Mutation. Trotz der Wirksamkeit der MAPKi Behandlung erfährt ein Teil der Patienten, die während der Behandlung auf die Inhibitoren angesprochen haben, innerhalb kurzer Zeit ein Rezidiv. Dieses kurzfristige, schnelle, erneute Tumorwachstum wird auch als Rebound-Wachstum bezeichnet und stellt ein signifikantes klinisches Problem dar.

Um das Rebound-Wachstum in vitro während und nach MAPKi Behandlung zu modellieren, wurden vier Zellmodelle, die von humanen Tumoren etabliert wurden, mittels Zellzahlzählungen getestet. Anschließend wurde ein Multi-Omics Datensatz mittels RNA-Sequenzierung und LC-MS/MS-basierter Phospho-/Proteomik von dem Rebound-Modell erstellt. Basierend auf diesem Datensatz wurden Mechanismen identifiziert, die möglicherweise eine Rolle während des Rebound-Wachstums spielen könnten, und anschließend in vitro und in vivo validiert. Von den getesteten Modellen zeigten BT-40 Zellen (BRAFV600E, CDKN2A/Bdel) ein Rebound-Wachstum, welches durch ein früheres, erneutes Zellwachstum nach Absetzen der MAPKi Behandlung im Vergleich zu Chemotherapeutika gekennzeichnet war und somit die Beobachtungen in Patienten wiederspiegelt. Auf molekularer Ebene zeigte dieses Model eine Reaktivierung des MAPK-Signalwegs innerhalb weniger Stunden nach Behandlungsstop, welches mit einer transienten Überaktivierung zentraler MAPK-Elemente auf transkriptioneller (z.B. FOS) und posttranslationaler (z.B. MEK-Phosphorylierung) Ebene einherging. Zusätzlich führte MAPKi Behandlung zu einer erhöhten Aktivität des AKT-Signalweges sowie einer erhöhten Expression und Sekretion von Zytokinen, insbesondere CCL2, CX3CL1, CXCL10 und CCL7, welche auch bis 6-24 Stunden nach Behandlungsstop erhalten blieben. Weder die erhöhte AKT-Aktivität noch erhöhte Zytokinexpression beinflussten das Rebound-Wachstum auf eine tumorzellintrinsische Weise. Erhöhte Zytokinsekretion während und nach MAPKi Behandlung führte jedoch zu einer erhöhten Anziehung von Mikrogliazellen. Die schnelle Reaktivierung des MAPK-Signalwegs während des Rebound-Wachstums sowie die erhöhte Expression von CX3CL1 und CXCL10 während MAPKi Behandlung konnten zudem in vivo in einem orthotopen BT-40-Xenotransplantationsmodell nachgewiesen werden.

Zusammenfassend zeigen diese Daten eine schnelle Reaktivierung des MAPK-Signalweges als potentiellen, tumorzellintrinsischen, Rebound-antreibenden Mechanismus. Dies deutet darauf hin, dass Modulation der MAPK-Aktivität nach Behandlungsstop eine mögliche Strategie sein könnte, um das Rebound-Wachstum zu verhindern, die weiter untersucht werden sollte. Darüber hinaus konnte ich nachweisen, dass die erhöhte Zytokinproduktion, induziert durch die MAPKi Behandlung, zu einer erhöhten Anziehung von Mikrogliazellen führt. Dies legt nahe, dass Immunzellen, insbesondere Mikrogliazellen, innerhalb des Tumor-Mikromillieus eine Rolle während der MAPKi-Behandlung sowie während des Rebound-Wachstums spielen, welche in zukünftigen Studien weiter untersucht werden sollte.