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PDF, English - main document Download (30MB) | Lizenz: MINFLUX Tracking of Endogenous Dynein in Live Neurons by Schleske, Jonas Michael underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0

Abstract

MINFLUX represents a novel class of optical nanoscopy techniques, enabling tracking measurements with nanometer/millisecond spatiotemporal precision by requiring substantially fewer detected photons than established methods for molecular tracking. By leveraging this photonefficient precision, MINFLUX permitted the use of a comparatively small fluorescent label to directly observe the nanometer-sized steps of the molecular motor dynein in living primary neurons at physiological adenosine 5′-triphosphate (ATP) concentrations, which was previously only feasible in vitro and at markedly decelerated conditions. To tag dynein endogenously at different sites, CRISPR/Cas9 genome editing was implemented, and the successful tagging was confirmed through the utilization of a self-built widefield microscope. During MINFLUX tracking measurements, reversals within bidirectional axonal transport were observed to occur on a time scale corresponding to individual steps, indicating the presence of a rapid reversal mechanism that is distinct from a stochastic tug-of-war-like behavior. The analysis of the millisecond-short dwell times between consecutive steps revealed that the mechanochemical cycle is single-rate limited, indicating that dynein consumes one ATP to perform a step. Having established MINFLUX tracking of endogenous dynein in live neurons, it is anticipated that MINFLUX will facilitate further minimally invasive studies of rapid and undisturbed protein dynamics in live cells.

Translation of abstract (German)

MINFLUX ist eine neuartige Form der optischen Nanoskopie und ermöglicht die Einzelmolekül-Verfolgung mit einer räumlichen und zeitlichen Präzision im Nanometer-/Millisekundenbereich, indem wesentlich weniger detektierte Photonen benötigt werden als bei etablierten Methoden. Durch die Nutzung dieser photoneneffizienten Präzision ermöglichte MINFLUX die Verwendung einer vergleichsweise kleinen Fluoreszenzmarkierung, um die nanometerkleinen Schritte des molekularen Motors Dynein in lebenden primären Neuronen bei physiologischen Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP) direkt zu beobachten. Bislang war dies lediglich in vitro und unter deutlich verlangsamten Bedingungen möglich. Die endogene Markierung von Dynein an verschiedenen Stellen erfolgte mittels CRISPR/Cas9, wobei die erfolgreiche Markierung durch den Einsatz eines selbstgebauten Weitfeldmikroskops verifiziert wurde. Im Rahmen der MINFLUX Messungen konnten Richtungswechsel innerhalb des bidirektionalen axonalen Transports beobachtet werden, die auf einer Zeitskala von einzelnen Schritten auftraten. Dies weist auf das Vorhandensein eines schnellen Umkehrmechanismus hin, der sich von einem stochastischen Tauziehen-ähnlichen Verhalten unterscheidet. Die Analyse der Millisekunden kurzen Verweildauern zwischen aufeinanderfolgenden Schritten ergab, dass der mechanochemische Zyklus durch eine einzige Ratenkonstante begrenzt ist, was wiederum darauf hindeutet, dass Dynein ein ATP pro Schritt verbraucht. Die Etablierung der Einzelmolekül-Verfolgung von endogenem Dynein in lebenden Neuronen mittels MINFLUX eröffnet die Möglichkeit, mit MINFLUX weitere minimal-invasive Studien zur schnellen und ungestörten Proteindynamik in lebenden Zellen durchzuführen.