Preview

PDF, English - main document Download (10MB) | Lizenz: Developmental constraints and the regulatory logic of Drosophila enhancers by Alvarez Canales, Gilberto Alejandro underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0

Abstract

Summary Enhancers can generate specific patterns of gene expression, which are essential for organismal development. Despite decades of research, how enhancers encode the information necessary to drive these precise patterns remains unclear. To address this question, in this project, I focused on the interplay of two different approaches: 1) Using well-known endogenous enhancers, I searched for putative missing regulatory elements by integrating information from different mutational screenings, and 2) Using the combination of synthetic enhancers expression profiles and thermodynamic models, I tested the possibility of several mechanisms of their associated Transcription Factors (TFs). In the first approach, I focused on two of the best-characterized animal enhancers, the minimal stripe 2 enhancer (MS2E) and the E3N enhancer. The MS2E enhancer can generate the second of the seven stripes of the Even-skipped gene expression pattern. The E3N enhancer regulates the expression of the Shavenbaby gene, which has an eight-striped pattern. For the MS2E enhancer, a systematic and targeted mutagenesis screening was performed and analyzed, while for the E3N enhancer, I analyzed data from a randomized mutagenesis approach. For both enhancers, I estimated and associated affinity changes of multiple TF binding sites (TFBSs) with the observed expression phe- notypes. A dense encoded architecture was observed for the two enhancers where almost each mutated section generates a phenotype that differs from the wild-type. Affinity changes and motif turnover analyses of known TFBSs could explain only a small fraction of these phenotypes. Finally, I explored experimental alterna- tives for finding additional associated TFs and the evolutionary implications of a dense encoded enhancer architecture. These results suggest the need to find ad- ditional regulators and improve current versions of the binding profiles of already known TFs. In the second approach, I evaluated the roles of early patterning TFs through synthetic enhancers and mechanistic modeling. I observed that early embryonic enhancers are associated with higher information at the sequence level composition than later and synthetic random enhancers. Additionally, the syn- thetic system could encode different sharp gene expression patterns with different combinations of known TFBSs. The results from implementing generalized ther- modynamic models suggested that these TFs are highly context-dependent. This analysis suggested multiple equally performing mechanisms for different possibili- ties for TF-TF interactions, TF function, and modes of regulation. These models could predict observed expression patterns, such as a broad stripe in the center of the embryo, but other expression patterns, such as the presence of additional anterior expression, could not be explained. Finally, I propose alternative mecha- nisms by which known TFs work in this context and new directions for enhancer design to expand the understanding of encoding developmental patterns.

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung

Enhancer können spezifische Muster der Genexpression erzeugen, die für die Entwicklung von Organismen unerlässlich sind. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist noch immer unklar, wie Enhancer die Informationen kodieren, die für die Erzeugung dieser präzisen Muster erforderlich sind. Um diese Frage zu beant- worten, habe ich mich in diesem Projekt auf das Zusammenspiel zweier unter- schiedlicher Ansätze konzentriert: 1) Unter Verwendung bekannter endogener En- hancer habe ich nach mutmaßlich fehlenden regulatorischen Elementen gesucht, indem ich Informationen aus verschiedenen Mutationsscreenings integriert habe, und 2) Unter Verwendung der Kombination von Expressionsprofilen synthetischer Enhancer und thermodynamischen Modellen habe ich die zugehörigen Transkrip- tionsfaktoren (TFs) auf die Möglichkeit mehrerer Mechanismen hin getestet. Im ersten Ansatz habe ich mich auf zwei der am besten charakterisierten tierischen Enhancer konzentriert, den Minimal Stripe 2 Enhancer (MS2E) und den E3N Enhancer. Der MS2E Enhancer kann den zweiten der sieben Streifen des Even- skipped-Genexpressionsmusters erzeugen. Der E3N Enhancer reguliert die Expres- sion des Shavenbaby-Gens, das ein acht-Streifen-Muster aufweist. Für den MS2E- Enhancer wurde ein systematisches und gezieltes Mutagenese-Screening durchge- führt und analysiert, während ich für den E3N-Enhancer Daten aus einem ran- domisierten Mutagenese-Ansatz analysierte. Für beide Enhancer schätzte ich Affinitätsänderungen mehrerer TF-Bindungsstellen (TFBSs) und assoziierte sie mit den beobachteten Expressionsphänotypen. Für die beiden Enhancer wurde eine dichte codierte Architektur beobachtet, bei der fast jeder mutierte Abschnitt einen Phänotyp erzeugt, der sich vom Wildtyp unterscheidet. Affinitätsänderungen und Motivumsatzanalysen bekannter TFBSs konnten nur einen kleinen Teil dieser Phänotypen erklären. Schließlich untersuchte ich experimentelle Alternativen zum Auffinden zusätzlicher assoziierter TFs und die evolutionären Auswirkungen einer dichten codierten Enhancer-Architektur. Diese Ergebnisse legen die Notwendigkeit nahe, zusätzliche Regulatoren zu finden und aktuelle Versionen der Bindungspro- file bereits bekannter TFs zu verbessern. Im zweiten Ansatz habe ich die Rolle früher musterbildender TFs durch synthetische Enhancer und mechanistische Mod- ellierung untersucht. Ich habe beobachtet, dass frühe embryonale Enhancer mit mehr Informationen auf Sequenzebene verbunden sind als spätere oder zufällige synthetische Enhancer. Darüber hinaus konnte das synthetische System verschiedene scharfe Genexpressionsmuster mit verschiedenen Kombinationen bekannter TFBSs kodieren. Die Ergebnisse aus der Implementierung verallgemeinerter thermody- namischer Modelle deuteten darauf hin, dass diese TFs stark kontextabhängig sind. Diese Analyse deutete auf mehrere gleich funktionierende Mechanismen für verschiedene Möglichkeiten von TF-TF-Interaktionen, TF-Funktionen und Reg- ulierungsarten hin. Diese Modelle konnten beobachtete Expressionsmuster vorher- sagen, wie etwa einen breiten Streifen in der Mitte des Embryos, aber andere Ex- pressionsmuster, wie etwa das Vorhandensein zusätzlicher anteriorer Expression, konnten nicht erklärt werden. Abschließend schlage ich alternative Mechanismen vor, mit denen bekannte TFs in diesem Zusammenhang funktionieren, und neue Richtungen für das Enhancer-Design, um das Verständnis der Kodierung von En- twicklungsmustern zu erweitern.