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Abstract

Chromatin accessibility at cis-regulatory elements (CREs) is influenced by both cis- encoded and trans-acting mechanisms. This includes short DNA motifs recognized by transcription factors (TFs), as well as chromatin post-translational modifications on histones (PTMs). A challenge in identifying determinants of chromatin accessibility is that TF binding and deposition of activating chromatin marks are often concomitant at endogenous CREs, making it difficult to disentangle their individual contribution to chromatin accessibility and transcription activation. To overcome this limitation, I established a chromatin-integrated reporter assay to test whether regulatory sequences (~250bp) can recruit TFs, open chromatin, and activate transcription at an ectopic site. I created libraries containing hundreds of regulatory sequences and inserted them at the same landing pad located at a chromatin locus devoid of activating or repressing chromatin marks. I profiled whether these short genetic elements could recapitulate their endogenous chromatin accessibility using a parallelized chromatin accessibility assay based on targeted Single Molecule Footprinting. I analyzed ~400 fragments containing promoters and enhancers active in mouse embryonic stem cells (mESCs), and compared the chromatin accessibility at ectopic sites with their endogenous levels. As expected, CTCF-containing sequences (used as positive control) autonomously re-establish chromatin accessibility at identical levels when inserted at the ectopic locus. In contrast, sequences bound by other TFs, including NRF1, NFY and pluripotency factors such as KLF4, OCT4 show only partial recapitulation of their endogenous accessibility when isolated at the ectopic site; and this reduction was not explained by CpG content alone. To investigate whether sequence context beyond the core ~250 bp CRE could explain reduced accessibility, I performed a fragment-length experiment on a single CRE. Although preliminary, the results suggest that accessibility at the ectopic site reached endogenous levels at ≥1 kb. This suggests that, although the regulatory sequences are genetically the same of their endogenous counterparts, the ~250 bp fragments inserted at the ectopic locus may lack additional sequence features required for full activity – such as histone PTMs, whose deposition depends on cooperative interactions between multiple TFs. To further explore this possibility, I next investigated the role of H3K27Ac and found that the extent to which CREs establish chromatin accessibility is anti-correlated with the presence of H3K27Ac at the endogenous locus, suggesting that H3K27Ac may enhance accessibility in its native context. To test this hypothesis, I globally perturbed acetylation by chemically inhibiting the histone acetyltransferase p300, that deposits acetylation at a subset of enhancers in mESCs. As predicted, chromatin accessibility was reduced at endogenous loci, and the amplitude of the loss scaled with the degree of H3K27Ac reduction, but almost unaffected at the ectopic locus, which is located within a chromatin neutral environment. Finally, I implemented a proof-of-concept reporter assay to simultaneously quantify chromatin accessibility and transcriptional output for multiple ectopically inserted CREs, demonstrating the feasibility of parallel measurements at scale.

Translation of abstract (German)

Die Zugänglichkeit von Chromatin an cis-regulatorischen Elementen (CREs) wird sowohl durch cis-kodierte als auch trans-wirkende Mechanismen beeinflusst. Dazu gehören kurze DNA-Motive, die von Transkriptionsfaktoren (TFs) erkannt werden, sowie posttranslationale Modifikationen (PTMs) des Chromatins. Eine Herausforderung bei der Identifizierung der Bestimmungsfaktoren für Chromatinzugänglichkeit besteht darin, dass TF-Bindung und die Anlagerung aktivierender Chromatinmarkierungen an endogenen CREs häufig gleichzeitig auftreten, was es schwierig macht, ihren jeweiligen Beitrag zur Chromatinzugänglichkeit und Transkriptionsaktivierung auseinanderzuhalten. Um diese Einschränkung zu überwinden, habe ich einen chromatinintegrierten Reporter-Assay entwickelt, um zu testen, ob regulatorische Sequenzen (~250) Transkriptionsfaktoren rekrutieren, Chromatin öffnen und Transkription an einem ektopischen Ort aktivieren können. Ich habe Bibliotheken mit hunderten von regulatorischen Sequenzen erstellt und sie an derselben Zielstelle eingefügt – einem Chromatin-Locus ohne aktivierende oder reprimierende Chromatinmarkierungen. Mit einem parallelisierten Chromatinzugänglichkeits-Assay basierend auf gezieltem Single Molecule Footprinting habe ich analysiert, ob diese kurzen genetischen Elemente ihre endogene Chromatinzugänglichkeit nachbilden können. Ich habe etwa 400 Fragmente untersucht, die Promotoren und Enhancer enthalten, die in embryonalen Stammzellen der Maus (murine ES- Zellen) aktiv sind, und die Chromatinzugänglichkeit an ektopischen Stellen mit ihren endogenen Niveaus verglichen. Wie erwartet, stellten CTCF-haltige Sequenzen (verwendet als positive Kontrolle) die Chromatinzugänglichkeit autonom auf identischem Niveau wieder her, wenn sie an die ektopische Stelle eingefügt wurden. Im Gegensatz dazu zeigten Sequenzen, die von anderen TFs wie NRF1, NFY und Pluripotenzfaktoren wie KLF4, OCT4 gebunden werden, nur eine teilweise Reaktivierung ihrer endogenen Funktion, wenn sie isoliert an der ektopischen Stelle getestet wurden – dieser Rückgang konnte nicht allein durch den CpG-Gehalt erklärt werden. Um zu untersuchen, ob die reduzierte Zugänglichkeit von CREs über den ~300 bp hinausreichenden Sequenzkontext erklärt werden könnte, habe ich ein Fragmentlängen-Experiment mit einem einzelnen CRE durchgeführt. Trotz vorläufiger Ergebnisse, deuten diese darauf hin, dass die Zugänglichkeit an der ektopischen Stelle bei einer Fragmentlänge von ≥1 kb das endogene Niveau erreichte. Dies legt nahe, dass die ~250 bp langen Fragmente, obwohl genetisch identisch mit ihren endogenen Gegenstücken, möglicherweise zusätzliche Sequenzmerkmale für die volle Aktivität fehlen – etwa Histon- PTMs, deren Anlagerung von kooperativen Interaktionen mehrerer TFs abhängt. Um diese Möglichkeit weiter zu untersuchen, habe ich die Rolle von H3K27Ac analysiert und festgestellt, dass das Ausmaß, in dem CREs Chromatinzugänglichkeit herstellen, negativ mit der Präsenz von H3K27Ac am endogenen Locus korreliert. Dies deutet darauf hin, dass H3K27Ac in seinem natürlichen Kontext die Zugänglichkeit fördern kann. Um diese Hypothese zu testen, habe ich die Acetylierung global gestört, indem ich die Histonacetyltransferase p300 – die an einem Teil der Enhancer in murine ES-Zellen Acetylierung anbringt – chemisch gehemmt habe. Wie vorhergesagt, nahm die Chromatinzugänglichkeit an endogenen Loci ab, und das Ausmaß des Verlusts korrelierte mit der Stärke der H3K27Ac-Reduktion – war jedoch an der ektopischen Stelle, die sich in einer chromatinneutralen Umgebung befindet, kaum betroffen. Abschließend habe ich einen Proof-of-Concept-Reporter-Assay entwickelt, um gleichzeitig die Chromatinzugänglichkeit und die Transkriptionsaktivität für mehrere ektopisch eingefügte CREs zu quantifizieren, und damit die Machbarkeit paralleler Messungen im großen Maßstab demonstriert.