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Abstract

Die Vergrößerung des Öffnungswinkels entlang des optischen Achse eines Mikroskopes durch die kohärente Überlagerung der Foki zweier sich gegenüberstehender Objektive (4Pi-Anordnung) ermöglicht die Erzeugung der lichteffizientesten und schärftesten Punktbildfunktionen, um die dreidimensionale Auflösung in der Fernfeldmikrokopie weit unter die Beugungsgrenze zu bringen. Um bei diesem Verfahren jedoch möglichst eindeutige Aufnahmen zu erhalten, müssen die detektierten Signale, von Hintergrundsignalen über- und unterhalb der Fokalebene getrennt werden. Bisher wurden deshalb hauptsächlich nur fixierte Proben untersucht, da deren Aufnahmebedingungen sehr gut kontrolliert werden können. In dieser Arbeit stelle ich ein hochauflösendes 4Pi-Verfahren vor, das Aufnahmen von lebenden Zellen mit vernachlässigbarem Hintergrundsignal und Lichtschäden ermöglicht. Basierend auf RESOLFT Mikroskopie mit schaltbaren fluoreszierenden Proteinen und Zweiphotonenaktivierung und in Verbindung mit modifizierten Probenprotokollen und optimierter Optik zur Vorbeugung von Aberrationen, ermöglicht es einen robusten Zugang zu dicht gepackten, entlang der optischen Achse ausgedehnten, zellulären Regionen, die bislang weitestgehend vermieden wurden. Die Auflösung und die Signalqualität der Aufnahmen konnten zudem weiter durch die zeitliche Auswertung des Auslesesignals, auf Grund der hohen molekularen Sensitivität der entwickelten Methode auf lokale Schaltraten der Proteine, verbessert werden.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

By enlarging the aperture along the optic axis, the coherent utilization of opposing objective lenses (4Pi arrangement) has the potential to offer the sharpest and most light-efficient point spread functions in three-dimensional (3D) far-field fluorescence nanoscopy. However, to obtain unambiguous images, the signal has to be discriminated against contributions from lobes above and below the focal plane, which has tentatively limited the 4Pi arrangements to the imaging of fixed samples with controllable optical conditions. In this thesis, the 4Pi scheme was applied to RESOLFT nanoscopy using two-photon absorption for on-switching of fluorescent proteins and low-aberration sample optics. In this configuration, the lobes are so low that low-light level 3D-nanoscale imaging of living cells becomes possible. This methods thus offers robust access to densely packed, axially extended cellular regions that have been notoriously difficult to super-resolve. The approach also entails a fluorescence read-out scheme that translates molecular sensitivity to local off-switching rates into improved signal-to-noise ratio and resolution.