Englische Übersetzung des Titels: Wide Field Microscopy with Structured Illumination: Application to Functional Brain Imaging

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Abstract

Der Vorteil der Weitfeldmikroskopie bei der funktionellen Hirnabbildung gegenüber der oft angewendeten Laserscanningmikroskopie ist, daß sie eine parallele Aufnahme an vielen Stellen mit hoher Geschwindigkeit erlaubt. Dabei ist jedoch eine Tiefendiskrimination der Signale nur sehr eingeschränkt möglich. In dieser Arbeit wird erstmals untersucht, wie die Methode der strukturierten Beleuchtung, mit der optische Schnittbildung in die Weitfeldmikroskopie eingeführt wird, für die funktionelle Hirnabbildung eingesetzt werden kann. Es mußte eine andere Art der Gitterbewegung für Aufnahmen mit hoher Geschwindigkeit und ein neuer Algorithmus zur Gewinnung schneller und schwacher Infokussignale entwickelt werden. Damit konnten in vitro funktionelle Signale gemessen und es konnte in vivo gezeigt werden, wie Außerfokuslicht die Intensität von Infokusstrukturen im konventionellen Weitfeldbild als umgekehrt erscheinen lassen kann. Es zeigte sich, daß das Signal-zu-Rausch Verhältnis im Vergleich zum konventionellen Weitfeldmikroskop durch Licht reduziert wird, das vor der Anwendung des Schnittbildungsalgorithmus auch von außerhalb der optischen Schnittdicke detektiert wird. Daher ist eine dem Laserscanningmikroskop vergleichbare Schnittdicke nicht sinnvoll, es wurde eine Schnittdicke von 90 Mikrometern realisiert, die ungefähr der Breite einer Hirnschicht einer Maus entspricht. Als zweiter maßgeblicher Faktor für das Signal-zu-Rausch Verhältnis erwies sich die Streuung im Gehirn, die die Infokusmodulation abschwächt. Deren Einfluß kann durch eine größere Anregungswellenlänge und breitere Gitterstreifen reduziert werden, ohne die Schnittdicke stark zu verbreitern.

Übersetzung des Abstracts (Englisch)

In functional brain-imaging the advantage of wide-field microscopy versus the frequently used laser-scanning microscopy is the possibility of simultaneous recording at different locations with high speed. However, in doing so depth discrimination of the signals is very restricted. In this thesis it is investigated for the first time how the method of structured illumination which introduces optical sectioning into wide-field microscopy can be used for functional brain imaging. A new technique of grating movement for high speed recording with high velocity and a new algorithm to extract fast and weak in-focus signals had to be developed. Thus functional signals could be detected in vitro. Furthermore it was shown in vivo how out-of-focus light lets the intensity of in-focus structures seem reversed in the conventional wide field image. In comparison to the conventional wide-field microscope the signal-to-noise ratio is reduced by light detected from beyond the optical sectioning strength before the sectioning algorithm is applied. Hence the optical sectioning strength used in laser scanning microscopy is not applicable here. A sectioning strength of 90 micrometers which roughly corresponds to the thickness of one cortical layer in mouse was realized. The second relevant factor for the signal-to-noise ratio was scattering in the brain which diminished the in-focus modulation. Its effect can be reduced by a longer excitation wavelength and wider grating bars without strongly broadening sectioning strength.