German Title: Die Wnt-Kaskade und das Schicksal von Stammzellen in einem basalen Metazoon

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Abstract

The WNT signalling pathways have numerous controlling functions in embryonic development, pattern and axis formation of animals, but also play roles in sustained normal development. There are currently three known WNT signalling pathways, of which the canonical pathway is the most studied. This pathway functions not only in the establishment of the anterior-posterior axis and in cell differentiation, and is the only pathway known to play a role in stem cell fate and maintenance within many of the chordate metazoans. This work served to establish if such a role has already evolved early in metazoan phylogeny by using Hydractinia, a primitive eumetazoan as a model. This work established the presence of a WNT pathway in the hydrozoan Hydractinia. The WNT receptor in Hydractinia, He-frizzled, has been cloned and in situ expression in the life cycle suggest its putative function in budding and regeneration of polyps and in the proliferation of cells during the course of the normal development of the animal. Furthermore, the Hydractinia Frizzled(s) is the first gene from the WNT cascade(s) that was found to be expressed in cnidarian stem cells. Functional studies were carried out using inhibitors to a key enzyme of the canonical WNT pathway, GSK-3ß. Such an inhibition simulates the effect of the Wnt signal. Changes to colony morphology and effects on the stem cell population of Hydractinia were observed. Inhibitors caused ectopic formation of tentacles and heads, and also resulted in the formation of multiheaded polyps. Short treatment caused an initial high proliferation of cells followed by highly significant numbers of I-cells and a few days later, the I-cell differentiated products, namely the nerve and stinging cells. Long term exposure to the inhibitor led to slower growth of the colony, higher numbers of oogonia-like structures and an absence/lack of oocyte and eggs. All these data lend support the multiple functions the WNT pathway plays in this cnidarian and its involvement in the recruitment of stem cell derivatives from the population of I-cells. In a separate study, an attempt to study the fate of closely related chimeric partners in Hydractinia was carried out using microsatellites. An enrichment protocol gave high numbers of microsatellites compared to traditional shotgun methods. There exist microsatellites within Hydractinia, however efforts to find a locus polymorphic enough to discriminate between two closely related kin failed.

Translation of abstract (German)

Wnt-basierte Signalsysteme haben zahlreiche steuernde Funktionen in der Embryonalentwicklung der Tiere. Die gegenwärtige Forschung hebt ihre Rolle bei der Etablierung von Körperachsen und der Musterbildung hervor; sie haben aber auch Bedeutung in der postembryonalen Phase des Lebens. Dies gilt vor allem für den sogenannten kanonischen Signalweg, der im Säuger bei der Einrichtung der antero-posterioren Achse beteiligt ist, weiterhin bei der Steuerung der Zelldifferenzierung und zeitlebens bei der regenerativen Erneuerung von Geweben aus Stammzellen. Dies gilt auch für andere Wirbeltiere, auf die sich die Forschung bisher konzentriert hat. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel herauszufinden, ob Wnt-Signalsysteme bereits bei urtümlichen Metazoen mehrfache Rollen spielen und auch in das Schicksal von Stammzellen eingreifen. Untersucht wurde die Ontogenie von Hydractinia echinata, einem Vertreter der Cnidarier und damit der urtümlichsten Gruppe der Eumetazoa. Die Arbeit bestätigt das Vorkommen eines WNT-Systems in diesem Hydrozoon. Ein WNT-Rezeptor He-frizzled wurde geklont und seine in-situ Expression im ganzen Lebenszyklus untersucht. Die Expressionsmuster legen eine Rolle bei der Zellproliferation, der Anlage von Polypenknospen und der Kopfbildung in Polypenknospen nahe. Weiterhin ist Frizzled das erste Gen einer WNT-Kaskade das in I-Zellen, das heißt in multipotenten Stammzellen und ihren noch nicht terminal differenzierten Abkömmlingen, exprimiert wird. Es wurden funktionelle Studien durchgeführt mit Inhibitoren der GSK-3ß, einem Schlüsselenzym der kanonischen WNT-Kaskade. Gemäß Literaturangaben kann Inhibition von GSK-3 den Empfang eines WNT-Liganden imitieren. Eine solche Inhibition führt zu Änderungen der Morphologie der Polypen und in der I-Zellen-Population. Es traten ectopische Tentakel und multiple Köpfe auf. Kurzzeitige Behandlung führte zu einem Proliferationsschub in der I-Zellenpopulation gefolgt von einem Anstieg in der Zahl von I-Zellen-Derivaten, namentlich von Nervenzellen und Nesselzellen. Behandlung über längere Zeit führte auch zu einem Anstieg in der Zahl mutmaßlicher Oogonien, jedoch zur Reduktion der Zahl von Oocyten und reifen Eiern. Die gewonnenen Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass bereits bei den Cnidarier WNT-Signalsysteme mulrtiple Funktionen haben und bei der Rekrutierung von differenzierten Zellen aus dem Reservoir der Stammzellen beteiligt sind. In einer getrennten Studie wurde der Versuch unternommen, das Schicksal eng verwandter Partner in Chimaerenkolonien mittels molekularer Marker zu verfolgen. Als Marker wurden Mikrosatelliten gewählt. Ein Anreicherungsverfahren gab gute Ausbeuten. Es gibt Mikrosatelliten in Hydractinia, jedoch schlugen die Bemühungen fehl, einen polymorphen Locus zu finden, der es erlaubt hätte, eng verwandte Individuen genetisch zu unterscheiden.